Sekarang†Alamat saat ini: OX11 0DE, Inggris, Gedung Berlian, Taman Sains dan Inovasi Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Inggris, Sumber Cahaya Berlian Co., Ltd., Pusat Pencitraan Biologis Elektronik.
Pusat reaksi kompleks panen cahaya 1 (RC-LH1) adalah komponen fotosintesis inti dari bakteri fototrofik ungu. Kita ngenalin dua struktur mikroskop krio-elektron dari kompleks RC-LH1 dari Rhodopseudomonas palustris. Struktur resolusi 2.65-Å dari kompleks RC-LH114-W terdiri dari 14 loop subunit LH1 yang mengelilingi RC, yang terganggu oleh protein W, sementara kompleks tanpa protein-W sepenuhnya komposisi RC yang dikelilingi oleh RC. Ditutup 16 subunit LH1 loop. Perbandingan struktur ini memberikan wawasan tentang dinamika quinone di kompleks RC-LH1, termasuk perubahan konformasional yang sebelumnya belum ditentukan ketika mengikat quinone di situs RC QB, serta lokasi situs pengikatan quinone tambahan, yang membantu Melewatinya ke RC. Struktur unik dari protein W mencegah penutupan loop LH1, sehingga menciptakan saluran untuk mempercepat pertukaran quinone/quinolone.
Energi yang diberikan oleh fotosintesis dapat mempertahankan hampir semua kehidupan di bumi, dan memiliki potensi besar untuk bioteknologi surya. Sambil mempromosikan fotosintesis global, bakteri fototrofik ungu juga menunjukkan berbagai mode energi dan kemampuan metabolisme. Mereka bisa menghindari fotosintesis dan tumbuh sebagai bakteri heterotrofik di gelap, bisa memperbaiki nitrogen dan karbon dioksida, menghasilkan hidrogen, dan mendegradasi senyawa aromatik (1-3). Untuk memberikan energi untuk proses-proses ini, cahaya harus dengan cepat dan efisien diubah menjadi energi kimia. Proses ini dimulai ketika kompleks antena penjebak cahaya menyerap cahaya dan mentransfer energi yang terperangkap ke pusat reaksi (RC), sehingga memulai pemisahan muatan (4 - 7). Unit dasar fotosintesis di bakteri fototrofik ungu terdiri dari tipe 2 RC, dikelilingi oleh kompleks panen cahaya 1 (LH1), membentuk kompleks inti RC-LH1. LH1 dibentuk oleh susunan heterodimer αβ melengkung, yang masing-masing mengikat dua molekul klorofil bakteri (BChl) a dan satu atau dua karotenoid (8-12). Antena LH1 paling sederhana terdiri dari 16 atau 17 heterodimer αβ yang mengelilingi RC (9-13) dalam loop tertutup, tetapi di kompleks inti lainnya, peptida transmembran mengganggu kontinuitas LH1 di sekitarnya, sehingga mempromosikan difusi quinol / quinone antara RC dan kompleks sitokrom bc (1111, 13). Tanaman fototrofik ungu Rhodopseudomonas (Rps.) adalah organisme model yang dapat memahami energi dan transfer elektron yang mendukung fotosintesis. Struktur kristal pertama Rps. Model dari kompleks palustris RC-LH1 adalah RC, dikelilingi oleh 15 loop LH1 heterodimerik, yang terganggu oleh protein yang tidak diketahui yang disebut "Protein W" (14). Protein-W kemudian diidentifikasi sebagai RPA4402, yang merupakan protein 10.5kDa yang kagak dikarakterisasi dengan tiga heliks transmembran (TMH) yang diprediksi (16). Kita ngusulin buat ganti nama gen rpa4402 yang ngekode protein W jadi pufW biar konsisten dengan nomenklatur yang dipake buat gen yang ngekode subunit RC-L, M (pufL, pufM) dan LH1α, β (pufA, pufB). Menariknya, protein-W cuma ada di sekitar 10% dari RC-LH1, mengungkapkan Rps. palustris menghasilkan dua kompleks RC-LH1 yang berbeda. Di sini, kite ngelaporin struktur cryo-EM (cryo-EM) resolusi tinggi dari dua kompleks inti, satu dengan protein W dan 14 αβ heterodimer, yang laen tanpa protein W dan loop 16 Heterodimer LH1 tertutup. Struktur kite ngewakilin perubahan langkah dalam pemahaman kompleks RC-LH1 dari Rps. palustris, karena kite udah nganalisis populasi homogen dari tiap varian dan punya resolusi yang cukup buat nentuin dengan jelas tiap peptida dan pigmen terikat dan lipid terkait dan kinon. Perbandingan struktur ini nunjukin kalo tiga protein TMH-W yang belom ditemuin di kompleks RC-LH1 laen sejauh ini menghasilkan saluran quinone untuk mempercepat pertukaran quinone/quinolone. Sejumlah situs pengikatan lipid dan quinone yang dikonservasi telah diidentifikasi, dan kami telah mengungkapkan perubahan konformasional baru setelah kombinasi quinone dan RC, yang mungkin cocok untuk fotosistem II (PSII) RC dari organisme fototrofik beroksigen. Temuan kite ngasih wawasan baru tentang kinetika pengikatan dan pertukaran quinone/quinolone di kompleks inti RC-LH1 dari bakteri fototrofik ungu.
Untuk memfasilitasi studi rinci tentang dua kompleks yang ditemukan di Rps. palustris, kita isolasi tiap RC-LH1 dengan metode biokimia. Kompleks kekurangan protein W (selanjutnya disebut sebagai ΔpufW) dimurnikan dari strain yang kagak punya gen pufW (16), dan cuma satu kompleks RC-LH1 yang bisa diproduksi. Kompleks yang mengandung protein W diproduksi oleh strain. Protein W dari strain ini dimodifikasi dengan tag His 10x di C-terminus-nya, sehingga kompleks yang mengandung protein W dapat secara efektif dikombinasikan dengan sebagian besar protein W yang kurang dengan cara imobilisasi logam. Kompleks terpisah secara efektif (16) Kromatografi Afinitas (IMAC).
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1, kedua kompleks mengandung tiga sub-unit RC (RC-L, RC-M dan RC-H) yang dikelilingi oleh antena LH1. Struktur 2.80-A dari kompleks yang kagak punya protein-W nunjukin 16 αβ heterodimer, membentuk loop LH1 tertutup yang sepenuhnya mengelilingi RC, selanjutnya disebut sebagai kompleks RC-LH116. Struktur 2.65Å dari kompleks yang mengandung protein-W memiliki 14-heterodimer LH1 yang terganggu oleh protein-W, selanjutnya disebut sebagai RC-LH114-W.
(A dan B) Representasi permukaan dari senyawa. (C dan D) Pigmen terikat yang diekspresikan dalam batang. (E dan F) Kompleks yang diamati dari permukaan sitoplasma memiliki peptida dan subunit LH1 yang direpresentasikan dalam kartun, dan dinomorkan searah jarum jam dari celah protein-W [konsisten dengan penomoran Rba. kompleks sphaeroides (13)]. Untuk LH1-α, warna subunit protein adalah kuning; untuk LH1-β, warna subunit protein adalah biru; untuk protein-W, proteinnya merah; buat RC-H, itu cyan; buat RC-L, itu warnanya oranye; buat RC-M, magenta. Kofaktor diwakili oleh batang, ijo mewakili molekul BChl dan BPh a, ungu mewakili karotenoid, dan kuning mewakili molekul UQ10. (G dan H) Tampilan yang diperbesar dari celah protein-W di daerah setara kompleks RC-LH114-W (G) dan kompleks RC-LH116 (H). Kofaktor ditampilkan dalam bentuk pengisian ruang, quinone chelated ditampilkan dalam warna biru. Celah protein-W disorot oleh garis putus-putus biru di (G), dan lubang-lubang kecil di mana quinone/quinolol menyebar pada cincin LH116 disorot oleh garis putus-putus hitam di (H).
Gambar 1 (A dan B) nunjukin RC yang dikelilingi oleh susunan terbuka atau tertutup dari heterodimer LH1αβ, yang masing-masing mengikat dua BChl dan satu karotenoid (Gambar 1, C dan D). Penelitian sebelumnya udah nunjukin kalo Rps adalah kompleks LH1. Di jalur biosintesis spirulina xanthin, spesies ini mengandung populasi campuran karotenoid (17). Tapi, spiropyrroxanthin adalah karotenoid yang dominan dan kepadatannya memuaskan. Oleh karena itu, kami memilih untuk memodelkan spiroxanthin di semua situs pengikatan LH1. Polipeptida alfa dan beta adalah TMH tunggal dengan daerah luar membran pendek (Gambar 1, A, B, E, dan F). Meskipun kepadatan 17 residu di C-terminus kagak diamati, polipeptida alfa dibelah dari Met1 ke Ala46 di kedua kompleks. β polipeptida berkurang dari Gly4 ke Tyr52 di RC-LH116, dan dari Ser5 ke Tyr52 di RC-LH114-W. Gak ada kepadatan 3 atau 4 residu N-terminal atau 13 C-terminal yang diamati (Gambar S1). Analisis spektrometri massa dari kompleks RC-LH1 campuran yang disiapkan dari strain tipe liar menunjukkan bahwa daerah yang hilang adalah hasil dari pembelahan heterolog dari peptida-peptida ini (Gambar S1 dan S2). Formilasi N-terminal α-Met1 juga diamati (f). Analisis nunjukin kalo α-peptide terdiri dari residu fMet1 sampe Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, dan β-peptide terdiri dari residu Ser2 sampe Ala53, yang sesuai dengan peta kepadatan EM suhu rendah.
Koordinasi α-His29 dan β-His36 bikin BChls tatap muka; setiap αβ heterodimer merakit dengan tetangganya untuk membentuk loop terbuka (RC-LH114-W) atau loop tertutup (RC-LH116) di sekitar RC Array pigmen yang digabungkan eksiton (Gambar 1, C dan D). Dibandingin ama pita 877 nm RC-LH114-W, pergeseran merah penyerapan 880 nm RC-LH116 adalah 3 nm (Gambar 2A). Namun, spektrum dikroisme melingkar hampir sama (Gambar 2B), menunjukkan bahwa meskipun ada perbedaan yang jelas antara loop terbuka dan tertutup, lingkungan lokal BChls sangat mirip. Pergeseran merah penyerapan mungkin hasil dari pengurangan gerakan termal dan peningkatan stabilitas pada loop tertutup (18, 19), perubahan kopling pigmen yang disebabkan oleh loop tertutup (20, 21), atau kombinasi dari kedua efek ini (11).
(A) Spektrum penyerapan ultraviolet/terlihat/inframerah dekat, puncak-puncaknya ditandai dengan pigmen yang sesuai dan dinormalisasi ke puncak BPh pada 775 nm. (B) Spektrum dikroisme melingkar yang dinormalisasi ke absorbansi BChl pada 805 nm. (C dan D) Spektrum ΔA yang dipilih dari spektrum penyerapan yang diselesaikan waktu dari kompleks RC-LH114-W (C) dan kompleks RC-LH116 (D). Untuk perbandingan yang lebih baik, semua spektrum dinormalisasi ke ∆A dari -A pada 0.2 ps. (E) Laju oksidasi sitokrom c2 setelah iradiasi dengan adanya berbagai konsentrasi UQ2 (lihat Gambar S8 untuk data mentah). (F) Di sel yang tumbuh di bawah cahaya intensitas rendah, sedang atau tinggi (10, 30 atau 300μMm-2 s-1, masing-masing), subunit protein W dan RC-L dalam kompleks yang dimurnikan dan rasio membran yang dipisahin. Tentuin kadar protein dengan elektroforesis gel SDS-poliakrilamida dan imunoassay (liat Gambar S9 untuk data mentah). Tentuin rasio relatif terhadap kompleks RC-LH114-W yang dimurnikan. Rasio stoikiometri RC-L ke protein-W dari kompleks adalah 1:1.
BChls di posisi 1 di loop αβ14 yang cacat dari RC-LH114-W (Gambar 1, A, C, dan E) lebih deket ke donor utama RC (P) sebesar 6,8 Å daripada BChls yang setara di RC-LH116 (Gambar 1, B, D, dan F, dan S3); Tapi, kinetika penyerapan sementara dari dua kompleks menunjukkan bahwa untuk RC-LH114-W dan RC-LH116, konstanta waktu transfer energi eksitasi dari LH1 ke RC adalah 40 ± 4 dan 44 ± 3 ps (Gambar 2). , C dan D, Gambar S4 dan Tabel S2). Gak ada juga perbedaan yang signifikan dalam transfer elektronik dalam RC (Gambar S5 dan teks tambahan terkait). Kita curiga kalo korespondensi erat dari waktu transfer energi antara LH1 dan RC-P disebabkan oleh jarak, sudut, dan energi potensial yang sama dari sebagian besar BChl di dua loop LH1. Kayaknya kalo ngejelajahin pola energi LH1 buat nyampe jarak minimum kagak lebih cepet daripada transfer energi langsung dari situs yang kagak optimal ke RC. Loop LH1 open-loop di RC-LH114-W mungkin juga mengalami gerakan termal yang kagak signifikan di bawah kondisi suhu rendah untuk analisis struktural, dan ada konformasi cincin αβ14 yang lebih panjang pada suhu kamar dari jarak pigmentasi βBChls pada posisi RC 1.
Kompleks RC-LH116 mengandung 32 BChls dan 16 karotenoid, dan susunan keseluruhannya sama dengan yang diperoleh dari Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Bank Data Protein (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) strain DB (PDB) (PDB) 1997) dan ganggang hijau (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Setelah alignment, cuma penyimpangan kecil di posisi heterodimer αβ yang diamati, terutama 1-5, 15, dan 16 (Gambar S6). Kehadiran protein-W punya dampak yang signifikan pada struktur LH1. Tiga TMH-nya dihubungin oleh loop pendek, dengan N-terminal di sisi lumen kompleks dan C-terminal di sisi sitoplasma (Gambar 1A dan 3, A sampe D). Protein-W sebagian besar hidrofobik (Gambar 3B), dan TMH2 dan TMH3 berinteraksi dengan LH1αβ-14 untuk membentuk permukaan transmembran (Gambar 3, B dan E hingga G). Antarmuka terutama terdiri dari residu Phe, Leu dan Val di daerah transmembran. Residu-residu ini ditumpuk dengan asam amino hidrofobik dan pigmen αβ-14. Beberapa residu polar juga berkontribusi pada interaksi, termasuk ikatan hidrogen antara W-Thr68 dan β-Trp42 di permukaan rongga kompleks (Gambar 3, F dan G). Di permukaan sitoplasma, Gln34 berdekatan dengan kelompok keto karotenoid αβ-14. Selain itu, molekul n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) diselesaikan, dan ekor hidrofobiknya diperpanjang ke antarmuka antara protein-W dan αβ-14, dan ekor lipid mungkin terletak di tubuh. Kita juga perhatiin kalo daerah resolusi C-terminal protein W dan RCH deket banget, tapi kagak masuk lingkup pembentukan interaksi spesifik (Gambar 1, A dan E). Namun, mungkin ada interaksi dalam asam amino C-terminal yang belum terpecahkan dari dua protein ini, yang mungkin memberikan mekanisme untuk perekrutan protein-W selama perakitan kompleks RC-LH114-W.
(A) Protein-W, yang ngadep ke antarmuka dengan LH1αβ14 dalam bentuk kartun, memiliki rantai samping berbentuk batang (merah), yang ditampilkan di bagian diagram potensial elektrostatik (permukaan abu-abu transparan dengan tingkat kontur 0,13). (B) Protein-W yang diwakili oleh permukaan berwarna hidrofobik. Area polar dan bermuatan ditampilkan dalam warna cyan, area hidrofobik ditampilkan dalam warna putih, dan area yang sangat hidrofobik ditampilkan dalam warna oranye. (C dan D) Protein-W yang diwakilin di kartun, orientasinya sama kayak di (A) (C), dan diputar 180° (D). Sesuai posisi dalam urutan, residu yang dapat dibedakan mengadopsi skema warna pelangi, di mana N-terminal berwarna biru dan C-terminal berwarna merah. (E) Protein-W dalam tampilan yang sama seperti di (A), dan residu di antarmuka protein-W:LH1 diwakili oleh batang dengan tanda yang dipasang. (F) Protein-W diputar 90° relatif terhadap (E) dan LH1αβ14 dalam representasi kartun, dan relatif terhadap residu antarmuka dalam representasi batang. Residu yang menjuntai dari polipeptida beta diberi label. Kofaktor ditunjukin sebagai batang yang cocok dengan warna Gambar 1, β-DDM yang terurai ditunjukin dengan warna abu-abu, dan oksigen ditunjukin dengan warna merah. (G) Pandangan di (F) diputar 180°, dengan residu yang menonjol dari polipeptida alfa yang dicap.
Protein-W menggantikan heterodimer αβ (yang ke-15 di Gambar 1F), sehingga mencegah penutupan loop dan memiringkan tiga heterodimer αβ pertama. Diamati bahwa sudut kemiringan maksimum heterodimer αβ-1 pertama relatif terhadap normal film adalah 25° hingga 29° (Gambar 1, A dan E), yang dibentuk oleh kemiringan 2° hingga 8° αβ-1 di RC A kontras tajam-LH116 (Gambar 1, B dan F). Heterodimer kedua dan ketiga miring 12° sampe 22° dan 5° sampe 10°, masing-masing. Karena hambatan sterik RC, kemiringan αβ-1 kagak termasuk pasangan kedua αβ (yang sesuai dengan αβ ke-16 di Gambar 1F), sehingga membentuk celah yang jelas di cincin LH1 (Gambar 1, A dan E). Karena kurangnya dua heterodimer αβ, disertai dengan hilangnya empat BChl dan dua karotenoid, kagak ada satupun karotenoid yang mengikat subunit αβ-1 yang memutar, menghasilkan cincin LH114-W yang mengandung 13 karotenoid Vegetarian dan 28 BChls. Perkiraan resolusi lokal dari dua kompleks di daerah αβ1 hingga 7 lebih rendah daripada sisa loop LH1, yang mungkin mencerminkan plastisitas bawaan subunit LH1 yang berdekatan dengan situs RC QB (Gambar 4).
Gambar RC-LH114-W (A dan B) dan RC-LH116 (C dan D) ditunjukin dari tampilan atas/samping yang sama (A dan B) (A dan C) dan permukaan rongga Gambar 1. (B dan D). Tombol berwarna ditunjukin di sebelah kanan.
Satu-satunya kompleks inti karakteristik lain dengan rasio stoikiometri 1:14 adalah dimer Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Tapi, protein W dan PufX kagak punya homologi yang jelas, dan punya dampak yang signifikan pada struktur LH1 masing-masing. PufX adalah TMH tunggal dengan domain sitoplasma N-terminal yang berinteraksi dengan sisi sitoplasma subunit RC-H (13) di posisi yang sesuai dengan Rps. palustris LH116αβ-16. PufX bikin saluran buat pertukaran quinone/quinolone antara RC-LH1 dan kompleks sitokrom bcl dan ada di semua Rba. kompleks inti sphaeroides (13). Meskipun antarmuka monomer-monomer ada di Rba. Dimer sphaeroides RC-LH1-PufX terletak di posisi pengikatan protein W di RC-LH114-W, dan celah yang diinduksi oleh PufX dan protein-W berada pada posisi yang setara (Gambar S7A). Celah di RC-LH114-W juga sejajar dengan saluran kinon hipotetis (8) dari Pseudomonas rosea LH1, yang dibentuk oleh peptida yang tidak terkait dengan protein W atau PufX (Gambar S7B). Selain itu, saluran quinone di Blc. LH1 ijo zamrud yang dibentuk dengan mengecualikan satu subunit γ (7) terletak di posisi yang sama (Gambar S7C). Meskipun dimediasi oleh protein yang berbeda, munculnya saluran quinone/quinolol ini di posisi yang sama di kompleks RC-LH1 tampaknya menjadi contoh evolusi konvergen, yang menunjukkan bahwa celah yang dibuat oleh protein W dapat bertindak sebagai saluran quinone.
Celah di loop LH114-W memungkinkan pembentukan daerah membran yang terus menerus antara ruang internal kompleks RC-LH114-W dan membran massal (Gambar 1G), daripada menghubungkan dua domain melalui pori protein seperti pada protein. Kompleks RC-LH116 mirip dengan Tch tertutup. Kompleks mirip jarum (22) (Gambar 1H). Karena difusi quinone melalui membran lebih cepat daripada difusi melalui saluran protein sempit, loop LH114-W terbuka dapat memungkinkan pergantian RC yang lebih cepat daripada loop LH116 tertutup, dan difusi quinone ke dalam RC mungkin lebih terbatas. Untuk ngetes apakah protein W mempengaruhi konversi kinon melalui RC, kami melakukan tes oksidasi sitokrom pada konsentrasi tertentu ubiquinone 2 (UQ2) (analog UQ10 alami dengan ekor isoprene yang lebih pendek) (Gambar 2E). Meskipun adanya quinone chelated menghambat penentuan akurat konstanta Michaelis yang jelas (RC-LH114-W dan RC-LH116 cocok untuk 0,2 ± 0,1 μM dan 0,5 ± 0,2 μM, masing-masing), tingkat maksimum RC-LH114-W ( 4,6 ± 0,2 μM) adalah s-LH114-W. 28±5% lebih gede dari RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Awalnya kite ngira kalo protein-W ada di sekitar 10% dari kompleks inti (16); di sini, tingkat hunian sel pertumbuhan cahaya rendah, cahaya sedang, dan cahaya tinggi adalah 15±0,6%, 11±1% dan 0,9±0,5, masing-masing % (Gambar 2F). Perbandingan kuantitatif spektrometri massa nunjukin kalo penambahan tag histidin kagak ngurangin kelimpahan relatif protein-W dibandingin strain tipe liar (P = 0,59), jadi tingkat-tingkat ini bukan artefak protein-W yang dimodifikasi (Gambar S10). Namun, penghunian rendah protein-W di kompleks RC-LH1 mungkin memungkinkan beberapa RC untuk berbalik dengan kecepatan yang dipercepat, sehingga meringankan pertukaran quinone / quinolone yang lebih lambat di kompleks RC-LH116. Kita perhatiin kalo tingkat penghunian cahaya yang tinggi kagak konsisten dengan data transkriptomik baru-baru ini, yang nunjukin kalo ekspresi gen pufW meningkat di bawah cahaya yang kuat (Gambar S11) (23). Perbedaan antara transkripsi pufW dan penggabungan protein-W ke dalam kompleks RC-LH1 membingungkan dan mungkin mencerminkan regulasi kompleks protein.
Di RC-LH114-W, 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) dan 29 molekul β-DDM dialokasikan dan dimodelkan di dalamnya 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG dan 21βD. RC-LH116 (Gambar 5, A dan B). Di dua struktur ini, CDL hampir terletak di sisi sitoplasma kompleks, sementara POPC, POPG dan β-DDM kebanyakan terletak di sisi luminal. Dua molekul lipid dan deterjen diisolasi di daerah αβ-1 hingga αβ-6 dari kompleks RC-LH114-W (Gambar 5A), dan lima diisolasi di daerah setara RC-LH116 (Gambar 5B). Lebih banyak lipid yang ditemuin di sisi lain kompleks, terutama CDL, yang terkumpul antara RC dan αβ-7 hingga αβ-13 (Gambar 5, A dan B). Lipid dan deterjen yang terselesaikan secara struktural terletak di luar cincin LH1, dan rantai asil yang terselesaikan dengan baik memanjang antara subunit LH1, yang secara tentatif ditunjuk sebagai β-DDM di RC-LH114-W, dan didefinisikan sebagai β-DDM di RC A campuran β-DDM dan PO-LH16-LH16. Posisi yang sama dari lipid dan deterjen chelating dalam struktur kita nunjukin kalo mereka adalah situs pengikatan yang relevan secara fisiologis (Gambar S12A). Posisi molekul setara di Tch juga punya konsistensi yang bagus. Lembut dan Trv. Strain 970 RC-LH1s (Gambar S12, B sampai E) (9, 12) dan residu ikatan hidrogen dari kelompok kepala lipid menunjukkan konservasi yang cukup baik dalam keselarasan urutan (Gambar S13), menunjukkan bahwa CDL yang dikonservasi yang mengikat ke RC (24), situs-situs ini mungkin dikonservasi dalam kompleks RCH-LH1.
(A dan B) RC-LH114-W (A) dan RC-LH116 (B) peptida diwakili oleh kartun, dan pigmen diwakili oleh batang, menggunakan skema warna di Gambar 1. Lipid ditunjukin dengan warna merah, dan deterjen ditunjukin dengan warna abu-abu. UQ yang terikat ke situs RC QA dan QB berwarna kuning, sementara UQ yang terisolasi berwarna biru. (C dan D) Pandangan yang sama dengan (A) dan (B), dengan lipid yang dihilangkan. (E ke G) Tampilan yang diperbesar dari Q1(E), Q2(F) dan Q3(G) dari RC-LH116, dengan rantai samping yang saling mempengaruhi. Ikatan hidrogen ditunjukin sebagai garis putus-putus hitam.
Di RC-LH116, RC QA dan QB UQ, yang berpartisipasi dalam transfer elektron dalam proses pemisahan muatan, terurai di tempat pengikatan mereka. Tapi, di RC-LH114-W, QB quinone belom diselesaikan dan bakal dibahas secara rinci di bawah ini. Selain kinon QA dan QB, dua molekul UQ yang dikelat (terletak di antara cincin RC dan LH1) dialokasikan dalam struktur RC-LH114-W sesuai dengan kelompok kepala mereka yang terselesaikan dengan baik (terletak di Q1 dan Q2, masing-masing). ruangan). Gambar 5C). Dua unit isoprene ditugasin ke Q1, dan peta kepadatan nyelesain 10 ekor isoprene lengkap dari Q2. Dalam struktur RC-LH116, tiga molekul UQ10 yang dikelat (Q1 hingga Q3, Gambar 5D) diselesaikan, dan semua molekul memiliki kepadatan yang jelas di seluruh ekor (Gambar 5, D hingga G). Di dua struktur, posisi kelompok kepala quinone Q1 dan Q2 memiliki konsistensi yang sangat baik (Gambar S12F), dan mereka hanya berinteraksi dengan RC. Q1 terletak di pintu masuk celah W RC-LH114-W (Gambar 1G dan 5, C, D dan E), dan Q2 terletak di dekat situs pengikatan QB (Gambar 5, C, D) dan F). Residu L-Trp143 dan L-Trp269 yang dikonservasi sangat dekat dengan Q1 dan Q2 dan memberikan interaksi π-stacking potensial (Gambar 5, E dan F, dan Gambar S12). L-Gln88, 3.0 Å dari oksigen distal Q1, nyediain ikatan hidrogen yang kuat (Gambar 5E); residu ini dilestarikan di semua RC kecuali hubungan yang paling jauh (Gambar S13). L-Ser91 secara konservatif digantiin Thr di kebanyakan RC lain (Gambar S13), adalah 3,8 Angstrom dari oksigen metil Q1, dan mungkin memberikan ikatan hidrogen lemah (Gambar 5E). Q3 kagak keliatan punya interaksi spesifik, tapi terletak di daerah hidrofobik antara subunit RC-M dan subunit LH1-α 5 sampe 6 (Gambar 5, D dan G). Q1, Q2 dan Q3 atau quinones chelated terdekat juga udah diselesaikan di Tch. Lembut, Trv. Strain 970 dan Blc. Struktur iris (9, 10, 12) nunjuk ke situs pengikatan quinone tambahan yang dikonservasi di kompleks RC-LH1 (Gambar S12G). Lima UQ yang terurai di RC-LH116 sesuai dengan 5,8 ± 0,7 dari setiap kompleks yang ditentukan oleh kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), sementara tiga UQ yang terurai di RC-LH114-W lebih rendah dari Nilai yang diukur 6,2 ± 0,3 (Gambar S14) menunjukkan bahwa tidak ada molekul UQ yang terurai. nyusun.
Polipeptida L dan M pseudo-simetris masing-masing mengandung lima TMH dan membentuk heterodimer yang menggabungkan satu dimer BChl, dua monomer BChl, dua monomer bakteriofag (BPh), dan satu besi non-Heme dan satu atau dua molekul UQ10. Lewat adanya ikatan hidrogen pada gugus keton terminal dan akumulasi yang diketahui di Rps, karotenoid dimasukin ke subunit M, yang dinamai cis-3,4-dehydroorhodopin. Spesies (25). Domain membran luar RC-H berlabuh ke membran oleh satu TMH. Struktur RC keseluruhan mirip dengan tiga subunit RC dari spesies terkait (seperti Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Siklus makro BChl dan BPh, tulang punggung karotenoid dan besi non-heme tumpang tindih dalam rentang resolusi struktur ini, seperti halnya kelompok kepala UQ10 di situs QA dan kinon QB di RC-LH116 (Gambar S15).
Ketersediaan dua struktur RC dengan tingkat penghunian situs QB yang berbeda memberikan kesempatan baru untuk memeriksa perubahan konformasional yang konsisten yang menyertai pengikatan quinone QB. Di kompleks RC-LH116, QB quinone terletak di posisi "proksimal" yang terikat penuh (26), tapi pemisahan RC-LH114-W kagak punya QB quinone. Gak ada QB quinone di RC-LH114-W, yang mengejutkan karena kompleksnya aktif, lebih dari kompleks RC-LH116 dengan QB quinone yang terselesaikan secara struktural. Meskipun dua cincin LH1 mengelat sekitar enam kinon, lima secara struktural diselesaikan di cincin RC-LH116 tertutup, sementara hanya tiga yang secara struktural terbatas di cincin RC-LH114-W terbuka. Gangguan struktural yang meningkat ini mungkin mencerminkan penggantian yang lebih cepat dari situs QB RC-LH114-W, kinetika quinone yang lebih cepat di kompleks, dan peningkatan kemungkinan melintasi loop LH1. Kita nyaranin kalo kurangnya UQ di situs RC QB RC-LH114-W mungkin hasil dari kompleks yang lebih kompleks dan lebih aktif, dan situs QB RC-LH114-W udah langsung dibekuin dalam pergantian UQ Tahap spesifik (pintu masuk ke situs QB udah ditutup) mencerminkan konformasi aktivitas ini.
Tanpa QB, rotasi L-Phe217 yang menyertai ke posisi yang kagak kompatibel dengan pengikatan UQ10, karena akan menyebabkan tabrakan spasial dengan unit isoprene pertama ekor (Gambar 6A). Selain itu, perubahan konformasi utama yang jelas jelas, terutama heliks de (heliks pendek di loop antara TMH D dan E) di mana L-Phe217 digeser ke kantong pengikatan QB dan rotasi L-Tyr223 (Gambar 6A) Untuk memutuskan ikatan hidrogen dengan kerangka pengikatan M-A4 dan menutup pintu pengikatan QB situs (Gambar 6B). Helix de pivot di dasarnya, Cα dari L-Ser209 bergeser 0.33Å, sementara L-Val221Cα bergeser 3.52Å. Gak ada perubahan yang bisa diliat di TMH D dan E, yang bisa ditumpuk di kedua struktur (Gambar 6A). Setau kite, ini adalah struktur pertama di RC alami yang nutup situs QB. Perbandingan dengan struktur lengkap (QB-bound) nunjukin kalo sebelum quinone berkurang, perubahan konformasi diperlukan untuk membuatnya masuk ke quinone. L-Phe217 berputar untuk membentuk interaksi π-stacking dengan kelompok kepala quinone, dan heliks bergeser ke luar, memungkinkan kerangka L-Gly222 dan rantai samping L-Tyr223 untuk membentuk jaringan ikatan hidrogen dengan struktur ikatan hidrogen yang stabil (Gambar 6, A dan C).
(A) Kartun tumpang tindih dari struktur hologram (rantai L, rantai oranye/M, magenta) dan apo (abu-abu), di mana residu kunci ditampilkan dalam bentuk representasi mirip batang. UQ10 diwakili oleh garis kuning. Garis putus-putus nunjukin ikatan hidrogen yang terbentuk di seluruh struktur. (B dan C) Representasi permukaan apolipoprotein dan seluruh struktur cincin, menyoroti oksigen rantai samping L-Phe217 dalam warna biru dan L-Tyr223 dalam warna merah, masing-masing. Subunit L berwarna oranye; subunit M dan H kagak berwarna. (D dan E) Apolipoprotein (D) dan seluruh (E) situs RC QB [warna oleh (A) masing-masing] dan Thermophilus thermophilus PSII (hijau, biru dengan kinon plastik; PDB ID: 3WU2) Sejajar (58).
Gak disangka, meskipun beberapa struktur RC yang kekurangan QB tanpa LH1 tersedia, perubahan konformasi yang diamati dalam penelitian ini belum dilaporkan sebelumnya. Ini termasuk struktur depletion QB dari Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) dan Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), yang semuanya hampir sama dengan struktur QB mereka secara keseluruhan. Pemeriksaan deket dari 3PRC ngungkapin kalo molekul deterjen LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) mengikat di pintu masuk posisi QB, yang mungkin mencegah penataan ulang ke konformasi tertutup. Meskipun LDAO kagak terurai di posisi yang sama di 1EYS atau 1OGV, RC ini disiapkan make deterjen yang sama dan karenanye bisa menghasilkan efek yang sama. Struktur kristal Rba. Sphaeroides RC yang dikristalkan bersama dengan sitokrom c2 (PDB ID: 1L9B) juga tampaknya memiliki situs QB tertutup. Namun, dalam hal ini, daerah N-terminal dari polipeptida RC-M (berinteraksi dengan situs pengikatan QB melalui ikatan H residu Tyr pada heliks Q) mengadopsi konformasi yang tidak alami, dan perubahan konformasi QB tidak dijelajahi lebih lanjut (30). Yang meyakinkan adalah kita belom ngeliat deformasi polipeptida M semacam ini di struktur RC-LH114-W, yang hampir sama dengan daerah N-terminal RC-LH116 RC. Perlu juga dicatet kalo setelah pemberantasan antena LH1 berbasis deterjen, RC apolipoprotein di PDB diselesaikan, yang ngilangin kolam kinon internal dan lipid di celah antara RC dan permukaan dalam cincin LH1 sekitarnya (31, 32). RC tetep berfungsi karena mempertahankan semua kofaktor, kecuali QB quinone yang dapat terurai, yang kurang stabil dan sering hilang selama proses persiapan (33). Selain itu, diketahui bahwa penghapusan LH1 dan lipid siklik alami dari RC dapat berdampak pada fungsi, seperti umur yang dipendek dari keadaan P+QB yang dipisahkan muatan (31, 34, 35). Oleh karena itu, kite berspekulasi bahwa keberadaan cincin LH1 lokal yang mengelilingi RC mungkin mempertahankan situs QB "tertutup", sehingga melestarikan lingkungan lokal di dekat QB.
Meskipun apolipoprotein (tanpa QB quinone) dan struktur lengkap cuma mewakili dua jepretan dari pergantian situs QB, bukan serangkaian peristiwa, ada indikasi bahwa pengikatan dapat digerbang untuk mencegah pengikatan ulang oleh hydroquinone Untuk menghambat penghambatan substrat. Interaksi quinolol dan quinone di dekat situs QB apolipoprotein mungkin berbeda, yang mengarah ke penolakan oleh RC. Udah lama diusulin kalo perubahan konformasional berperan dalam pengikatan dan pengurangan kinon. Kemampuan RC beku untuk mengurangi quinones setelah adaptasi gelap terganggu (36); Kristalografi sinar-X nunjukin kalo kerusakan ini disebabkan oleh kinon QB yang terjebak dalam konformasi "distal" sekitar 4,5 Å dari posisi proksimal aktif (26) , 37). Kita nyaranin kalo konformasi pengikatan distal ini adalah gambaran dari keadaan perantara antara apolipoprotein dan struktur cincin penuh, yang ngikutin interaksi awal dengan quinone dan pembukaan situs QB.
RC tipe II yang ditemuin di kompleks PSII dari bakteri fototrofik tertentu dan cyanobacteria, ganggang dan tanaman memiliki konservasi struktural dan fungsional (38). Keselarasan struktural yang ditunjukin di Gambar 6 (D dan E) menekankan kesamaan antara PSII RC dan situs QB dari kompleks RC bakteri. Perbandingan ini udah lama jadi model buat mempelajari sistem pengikatan dan reduksi quinone yang terkait erat. Publikasi sebelumnya menunjukkan bahwa perubahan konformasional disertai dengan pengurangan PSII quinones (39, 40). Oleh karena itu, mengingat konservasi evolusioner RC, mekanisme pengikatan yang sebelumnya belum diamati ini mungkin juga berlaku untuk situs QB PSII RC pada tanaman fototrofik beroksigen.
Rps ΔpufW (penghapusan pufW tanpa label) dan PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W yang diekspresikan dari lokus pufW alami) strain. palustris CGA009 udah dijelasin di kerjaan kite sebelumnya (16). Strain-strain ini dan induk tipe liar isogenik dipulihkan dari freezer dengan cara ngecoret sejumlah kecil sel di PYE (masing-masing 5 g liter -1) (disimpan di LB pada -80 °C, mengandung 50% (w/v) gliserol) protein, ekstrak ragi dan suksinat) agar [1.5%/v) piring. Piring diinkubasi semalaman di gelap di suhu kamar di bawah kondisi anaerobik, dan kemudian diterangi dengan cahaya putih (~50 μmolm-2 s-1) yang disediakan oleh bohlam halogen OSRAM 116-W (RS Components, UK) selama 3 hingga 5 hari sampai satu koloni muncul. Satu koloni digunakan untuk menginokulasi 10 ml medium M22+ (41) yang ditambahkan dengan 0,1% (w/v) asam casamino (selanjutnya disebut sebagai M22). Kultur ditanam dalam kondisi oksigen rendah dalam gelap pada suhu 34°C dengan digoyang pada 180 rpm selama 48 jam, dan kemudian 70 ml kultur diinokulasi dalam kondisi yang sama selama 24 jam. Kultur semi-aerobik dengan volume 1 ml digunakan untuk menginokulasi 30 ml medium M22 dalam botol kaca transparan sekrup universal 30 ml dan disinari dengan agitasi (~50 μmolm-2 s-1) selama 48 jam dengan gaya magnet steril Stirring rod. Terus 30 ml dari kultur diinokulasi dengan sekitar 1 liter kultur dalam kondisi yang sama, yang kemudian digunakan untuk menginokulasi sekitar 9 liter kultur yang diterangi pada ~200 μmolm-2 s-1 selama 72 jam. Sel-sel dipanen dengan sentrifugasi di 7132 RCF selama 30 menit, disuspensikan kembali dalam ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0), dan disimpan pada -20°C sampai dibutuhkan.
Setelah dicairkan, tambahkan beberapa kristal deoksiribonuklease I (Merck, Inggris), lisozim (Merck, Inggris) dan dua tablet penghambat protease holoenzim Roche (Merck, Inggris) ke sel yang disuspensi ulang. Di sel tekanan Prancis 20,000 psi (Aminco, USA), sel-sel terganggu 8 sampe 12 kali. Setelah ngilangin sel yang kagak pecah dan puing-puing yang kagak larut dengan sentrifugasi di 18.500 RCF selama 15 menit di 4°C, membran diendapkan dari lisa berpigmen dengan sentrifugasi di 113.000 RCF selama 2 jam di 43.000°C. Buang fraksi yang larut dan gantungin lagi membran berwarna di 100 sampe 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) dan homogenisasi sampe kagak ada agregat yang keliatan. Membran yang tersuspensi diinkubasi dalam 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) yang mengandung 2% (w/v) β-DDM selama 1 jam dalam gelap pada suhu 4°C dengan pengadukan pelan. Terus sentrifugasi di 70°C buat ngelarutin 150,000 RCF di 4°C selama 1 jam buat ngilangin sisa zat yang kagak larut.
Membran solubilisasi dari strain ΔpufW diterapkan ke kolom pertukaran ion DEAE Sepharose 50 ml dengan tiga volume kolom (CV) penyangga pengikatan [20 mM tris-HCl (pH 8,0) yang mengandung 0,03% (w / v) β-DDM]. Cuci kolom dengan dua penyangga pengikat CV, dan kemudian cuci kolom dengan dua penyangga pengikat yang mengandung 50 mM NaCl. Kompleks RC-LH116 dielusi dengan gradien linier 150 sampe 300 mM NaCl (dalam penyangga pengikatan) pada 1,75 CV, dan sisa kompleks pengikatan dielusi dengan penyangga pengikatan yang mengandung 300 mM NaCl pada 0,5 CV. Kumpulin spektrum serapan antara 250 dan 1000 nm, jaga fraksi dengan rasio serapan (A880/A280) lebih besar dari 1 di 880 sampe 280 nm, encerkan dua kali di penyangga pengikatan, dan pake prosedur yang sama lagi di kolom DEAE Pada pemurnian. Encerkan pecahan dengan rasio A880/A280 lebih tinggi dari 1.7 dan rasio A880/A805 lebih tinggi dari 3.0, lakukan putaran ketiga pertukaran ion, dan pertahankan pecahan dengan rasio A880/A280 lebih tinggi dari 2.2 dan rasio A880/A805 lebih tinggi dari 5.05. Kompleks yang dimurnikan sebagian dikonsentrasikan hingga ~2 ml dalam filter sentrifugal Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) (Merck, Inggris), dan dimuat pada kolom pengecualian ukuran Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, AS) yang mengandung 200 mM NaCl, kemudian dielusi pada penyangga yang sama. CV. Kumpulin spektrum penyerapan dari fraksi pengecualian ukuran, dan konsentrasikan spektrum penyerapan dengan rasio A880/A280 di atas 2,4 dan rasio A880/A805 di atas 5,8 hingga 100 A880, dan segera gunakan untuk persiapan kisi-kisi cryo-TEM atau penyimpanan Jaga di -8°C sampai diperlukan.
Membran solubilisasi dari strain PufW-His diterapkan ke kolom HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8,0) yang mengandung 200 mM NaCl dan 0,03% (w/w)) dalam penyangga IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolom dicuci dengan lima CV penyangga IMAC, dan kemudian dengan lima CV penyangga IMAC yang mengandung 10 mM histidin. Kompleks inti dielusi dari kolom dengan lima penyangga IMAC yang mengandung 100 mM histidin. Fraksi yang mengandung kompleks RC-LH114-W dikonsentrasikan hingga ~10 ml dalam tangki diaduk yang dilengkapi dengan filter Amicon 100,000 MWCO (Merck, Inggris), diencerkan 20 kali dengan penyangga pengikat, dan kemudian ditambahkan ke 25 ml Di kolom DEAE Sepharose, empat penyangga CV digunakan ke penyangga b terlebih dahulu. Cuci kolom dengan empat penyangga pengikat CV, lalu eluasi kompleks pada delapan CV pada gradien linier 0 hingga 100 mM NaCl (dalam penyangga pengikat), dan sisa empat CV yang mengandung penyangga pengikat 100 mM Kompleks sisa yang dielusi pada natrium klorida yang dikombinasikan dengan rasio A888/2802 dan lebih tinggi dari A. Rasio A880/A805 lebih tinggi dari 4.6 fraksi dikonsentrasikan ke ~2 ml di filter sentrifugal Amicon 100,000 MWCO, dan diisi dengan 1,5 CV IMAC di awal Penyangga diseimbangkan Superdex 200 16/600 kolom pengecualian ukuran, dan kemudian dielusi di penyangga yang sama di atas CV 1.1.5. Ngumpulin spektrum penyerapan dari fraksi pengecualian ukuran dan konsentrasikan spektrum penyerapan dengan rasio A880/A280 di atas 2,1 dan rasio A880/A805 di atas 4,6 hingga 100 A880, yang langsung digunakan untuk persiapan kisi TEM beku atau disimpan pada -8°C hingga dibutuhkan.
Leica EM GP immersion freezer dipake buat nyiapin kisi-kisi TEM suhu rendah. Kompleks diencerkan dalam penyangga IMAC ke A880 dari 50, dan kemudian 5μl dimuat ke jala tembaga berlapis karbon QUANTIFOIL 1.2/1.3 yang baru dibuang cahaya (Agar Scientific, Inggris). Inkubasi kisi-kisi di 20°C dan 60% kelembaban relatif selama 30 detik, lalu keringin selama 3 detik, lalu padamkan di etan cair pada -176°C.
Data dari kompleks RC-LH114-W direkam di eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) dengan mikroskop Titan Krios, yang bekerja pada tegangan percepatan 300kV, dengan pembesaran nominal 130.000× dan celah energi 200V. Gatan 968 GIF Quantum dengan detektor puncak K2 dipake buat ngerekam gambar dalam mode penghitungan buat ngumpulin data. Ukuran piksel yang dikalibrasi adalah 1.048Å, dan tingkat dosis adalah 3.83 e-Å-2s-1. Ngumpulin filmnya dalam 11 detik dan ngebagi jadi 40 bagian. Pake area yang dilapisi karbon buat fokusin lagi mikroskop, trus kumpulin tiga film per lubang. Total, 3130 film dikumpulkan, dengan nilai defokus antara -1 dan -3μm.
Data untuk kompleks RC-LH116 dikumpulkan menggunakan mikroskop yang sama di Laboratorium Biostruktur Asterbury (Universitas Leeds, Inggris). Data dikumpulkan dalam mode penghitungan dengan pembesaran 130 k, dan ukuran piksel dikalibrasi menjadi 1,065 Å dengan dosis 4,6 e-Å-2s-1. Filmnya direkam dalam 12 detik dan dibagi jadi 48 bagian. Total, 3359 film dikumpulkan, dengan nilai defokus antara -1 dan -3μm.
Semua pemrosesan data dilakukan di pipeline Relion 3.0 (42). Pake Motioncorr 2 (43) buat benerin gerakan sinar dengan pembobotan dosis, terus pake CTFFIND 4.1 (44) buat nentuin parameter CTF (fungsi transfer kontras). Fotomikrograf khas setelah tahap pemrosesan awal ini ditunjukin di Gambar 2. S16. Templat pemilihan otomatis dihasilkan dengan memilih secara manual sekitar 250 piksel dari 1000 partikel dalam bingkai 250 piksel dan tidak ada referensi klasifikasi dua dimensi (2D), sehingga menolak klasifikasi yang memenuhi kontaminasi sampel atau tidak memiliki karakteristik yang dapat dilihat. Terus, seleksi otomatis dilakuin di semua mikrofoto, dan RC-LH114-W adalah 849.359 partikel, dan kompleks RC-LH116 adalah 476.547 partikel. Semua partikel yang dipilih udah ngelewatin dua putaran klasifikasi 2D non-referensi, dan setelah setiap lari, partikel yang memenuhi area karbon, kontaminasi sampel, kagak ada fitur yang jelas atau partikel yang tumpang tindih kuat ditolak, menghasilkan 772.033 (90,9%) dan 359,678 (75,5%) partikel yang digunakan untuk klasifikasi 3D D digunakan untuk klasifikasi 3D. RC-LH114-W dan RC-LH116 masing-masing. Model referensi 3D awal dihasilkan menggunakan metode penurunan gradien stokastik. Pake model awal sebagai referensi, partikel yang dipilih diklasifikasikan ke dalam empat kategori dalam 3D. Pake model di kategori ini sebagai referensi, lakuin pemurnian 3D pada partikel di kategori terbesar, trus pake filter low-pass 15Å awal buat nutupin area pelarut, tambahin 6 piksel sisi lunak, dan pasca-proses piksel buat benerin fungsi transfer Modulasi puncak Gatan K2 dari detektor atas. Untuk dataset RC-LH114-W, model awal ini dimodifikasi dengan ngilangin kepadatan kuat di tepi masker (terputus dari kepadatan kompleks inti di UCSF Chimera). Model yang dihasilkan (resolusi RC-LH114-W dan RC-LH116 adalah 3,91 dan 4,16 Å, masing-masing) digunakan sebagai referensi untuk putaran kedua klasifikasi 3D. Partikel yang dipake dikelompokkan ke dalam kelas 3D awal dan kagak mengandung korelasi yang kuat dengan lingkungan. Tumpang tindih atau kurangnya fitur struktural yang jelas. Setelah putaran kedua klasifikasi 3D, kategori dengan resolusi tertinggi dipilih [Untuk RC-LH114-W, satu kategori adalah 377.703 partikel (44,5%), untuk RC-LH116, ada dua kategori, berjumlah 260.752 partikel (54,7% Wh), mereka hanya disejajarkan setelah yang sama setelahnya yang sama. rotasi awal dengan perbedaan kecil]. Partikel yang dipilih diekstrak ulang di kotak 400 piksel dan disempurnakan dengan penyempurnaan 3D. Masker pelarut dihasilkan menggunakan filter low-pass 15Å awal, ekspansi peta 3 piksel dan masker lunak 3 piksel. Pake penyempurnaan CTF per-partikel, koreksi gerak per-partikel dan putaran kedua penyempurnaan CTF per-partikel, penyempurnaan 3D, penyamaran pelarut dan pasca-pemrosesan dilakukan setelah setiap langkah untuk lebih menyempurnakan tekstur yang dihasilkan. Pake nilai batas FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) 0.143, resolusi model akhir RC-LH114-W dan RC-LH116 masing-masing adalah 2.65 dan 2.80Å. Kurva FSC dari model akhir ditunjukin di Gambar 2. S17.
Semua urutan protein diunduh dari UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) dipake buat ngebangun model homologi RC, yang berisi urutan protein RC-L, RC-M dan RC-H dan struktur kristal Rba. sphaeroides RC dijadiin templat (PDB ID: 5LSE) (46). Pake alat "fit map" di UCSF Chimera buat ngecocokin model yang dihasilin ke peta (47), ningkatin struktur protein, dan kofaktor [4×BChl a (nama residu perpustakaan monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), satu atau dua jenis UQ10 (U10), satu zat besi non-heme (Fe) dan satu heksadikokarilin (QAK)] pake Coot (48) buat nambahin. Karena QAK kagak tersedia di perpustakaan monomer, QAK diparameterisasi make alat eLBOW di PHENIX (49).
Berikutnya, subunit LH1 dibangun. Awalnya, alat konstruksi otomatis di PHENIX (49) dipake buat otomatis ngebangun bagian dari urutan LH1 make peta dan urutan protein LH1-α dan LH1-β sebagai masukan. Pilih subunit LH1 yang paling lengkap, ekstrak dan muat ke Coot, tambahkan secara manual urutan yang hilang di dalamnya, dan perbaiki seluruh struktur secara manual sebelum menambahkan dua BCls a (BCL) dan spirilloxanthin (CRT) [sesuai Rps yang relevan Kepadatan kompleks LH1 dan kandungan karotenoid yang diketahui. Spesies (17)]. Salin subunit LH1 lengkap, dan pake UCSF Chimera "Docking Map Tool" buat berlabuh di area non-model yang berdekatan dengan kepadatan LH1, dan kemudian perbaiki di Coot; ulangin prosesnye sampe semua subunit LH1 udah dimodelin. Untuk struktur RC-LH114-W, dengan mengekstrak kepadatan yang tidak dialokasikan di Coot, protein dibagi dari sisa komponen non-protein di peta Chimera USCF dan alat Autobuild digunakan untuk membangun model awal, dan sisa subunit (protein-W) Pemodelan. Di PHENIX (49). Tambahin urutan yang hilang ke model yang dihasilkan di Coot (48), dan kemudian perbaiki seluruh subunit secara manual. Kepadatan yang tersisa yang kagak dialokasikan cocok dengan kombinasi lipid (ID perpustakaan monomer PDB dari CDL = CDL, POPC = 6PL dan POPG = PGT), deterjen β-DDM (LMT) dan molekul UQ10 (U10). Pake optimasi PHENIX (49) dan optimasi manual di Coot (48) buat nyempurnain model awal yang lengkap sampe statistik model dan kualitas visual pas kagak bisa ditingkatin lebih lanjut. Akhirnya, pake LocScale (50) buat ngasah peta lokal, terus lakuin beberapa siklus pemodelan kepadatan yang kagak dialokasiin dan optimasi otomatis dan manual.
Peptida, kofaktor dan lipid dan quinon lain yang berlabuh dalam kepadatan masing-masing ditunjukkan pada Gambar 1 dan 2. S18 hingga S23. Informasi statistik dari model akhir ditunjukin di Tabel S1.
Kecuali kalo ditentuin laen, spektrum penyerapan UV/Vis/NIR dikumpulin di spektrofotometer Cary60 (Agilent, USA) pada interval 1 nm dari 250 nm sampe 1000 nm dan waktu integrasi 0,1 s.
Encerkan sampel di kuvet kuarsa dengan jalur 2 mm ke A880 dari 1, dan kumpulin spektrum penyerapan antara 400 dan 1000 nm. Spektrum dikroik melingkar dikumpulkan pada spektropolarimeter Jasco 810 (Jasco, Jepang) pada interval 1 nm antara 400 nm dan 950 nm pada laju pindai 20 nm min-1.
Koefisien kepunahan molar ditentukan dengan mengencerkan kompleks inti menjadi A880 sekitar 50. Encerkan volume 10μl dalam penyangga pengikat 990μl atau metanol, dan kumpulin spektrum penyerapan segera untuk meminimalkan degradasi BChl. Kandungan BChl dari setiap sampel metanol dihitung dengan koefisien kepunahan pada 771 nm dari 54,8 mM-1 cm-1, dan koefisien kepunahan ditentukan (51). Bagi konsentrasi BChl yang diukur dengan 32 (RC-LH114-W) atau 36 (RC-LH116) untuk menentukan konsentrasi kompleks inti, yang kemudian digunakan untuk menentukan spektrum penyerapan sampel yang sama yang dikumpulkan dalam koefisien Kepunahan penyangga. sejajar. Tiga pengukuran berulang diambil untuk setiap sampel, dan absorbansi rata-rata maksimum BChl Qy digunakan untuk perhitungan. Koefisien kepunahan RC-LH114-W yang diukur di 878 nm adalah 3280±140 mM-1 cm-1, sementara koefisien kepunahan RC-LH116 yang diukur di 880 nm adalah 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 diukur sesuai dengan metode di (52). Singkatnya, HPLC fase terbalik (RP-HPLC) dilakukan menggunakan sistem HPLC Agilent 1200. Larutkan sekitar 0.02 nmol RC-LH116 atau RC-LH114-W dalam 50μl 50:50 metanol:kloroform yang mengandung 0.02% (w/v) ferrik klorida, dan suntikkan pra-seimbang Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4 mm Larutkan pada 1-1-ml. 40°C di pelarut HPLC (80:20 metanol:2-propanol) pada kolom ×25 cm. Lakuin elusi isokratik di pelarut HPLC buat ngawasin absorbansi di 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoid) dan 780 nm (BChl) selama 1 jam. Puncak di kromatogram 275 nm pada 25,5 menit terintegrasi, yang kagak mengandung senyawa laen yang bisa dideteksi. Area terintegrasi digunain buat ngitung jumlah molar UQ10 yang diekstraksi dengan referensi kurva kalibrasi yang dihitung dari injeksi standar murni dari 0 sampe 5,8 nmol (Gambar S14). Setiap sampel dianalisis dalam tiga ulangan, dan kesalahan yang dilaporkan sesuai dengan SD dari rata-rata.
Larutan yang mengandung kompleks RC-LH1 dengan penyerapan Qy maksimum 0,1 disiapkan dengan 30 μM sitokrom jantung kuda yang berkurang c2 (Merck, Inggris) dan 0 sampai 50 μMUQ2 (Merck, Inggris). Tiga sampel 1-ml disiapkan pada setiap konsentrasi UQ2 dan diinkubasi semalaman dalam gelap pada suhu 4°C untuk memastikan adaptasi lengkap terhadap gelap sebelum pengukuran. Larutan dimuat ke spektrofotometer modular OLIS RSM1000 yang dilengkapi dengan 300 nm flame/500 line grating, 1.24 mm inlet, 0.12 mm tengah dan 0.6 mm celah outlet. Filter panjang 600 nm diletakkan di pintu masuk fototube sampel dan tabung fotomultiplier referensi untuk mengecualikan cahaya eksitasi. Absorbansi dipantau di 550 nm dengan waktu integrasi 0,15 detik. Cahaya eksitasi dipancarkan dari 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) melalui kabel serat optik pada intensitas 90% melalui pengontrol DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) dan dipancarkan ke sumber cahaya pada sudut 90°. Sinar pengukur berlawanan dengan cermin untuk mengembalikan cahaya yang awalnya tidak diserap oleh sampel. Pantau absorbansi 10 detik sebelum pencahayaan 50 detik. Terus absorbansi dipantau lebih lanjut selama 60 detik di gelap untuk menilai sejauh mana quinolol secara spontan mengurangi sitokrom c23 + (lihat Gambar S8 untuk data mentah).
Data diproses dengan ngepas laju awal linier dalam 0,5 sampe 10 detik (tergantung konsentrasi UQ2) dan rata-rata laju dari ketiga sampel di setiap konsentrasi UQ2. Konsentrasi RC-LH1 yang dihitung oleh koefisien kepunahan masing-masing digunakan untuk mengubah laju menjadi efisiensi katalitik, diplot di Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), dan dipasang ke model Michaelis-Menten untuk menentukan nilai Km dan Kcat yang jelas.
Untuk pengukuran penyerapan sementara, sampel RC-LH1 diencerkan hingga ~2μM dalam penyangga IMAC yang mengandung 50 mM natrium askorbat (Merck, USA) dan 0,4 mM Terbutin (Merck, USA). Asam askorbat digunain sebagai donor elektron pengorbanan, dan tert-butaclofen digunain sebagai penghambat QB untuk memastikan bahwa donor RC utama tetap berkurang (yaitu, tidak teroksidasi) sepanjang proses pengukuran. Sekitar 3 ml sampel ditambahkan ke sel berputar khusus (sekitar 0,1 m diameter, 350 RPM) dengan panjang jalur optik 2 mm untuk memastikan bahwa sampel di jalur laser memiliki waktu yang cukup untuk adaptasi gelap antara pulsa eksitasi. Pake pulsa laser ~100-fs buat nguatin sistem laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) buat ngebuat sampel di 880 nm dengan laju pengulangan 1 kHz (20 nJ buat NIR atau 100 nJ buat Vis). Sebelum ngumpulin data, ekspos sampel ke cahaya eksitasi selama sekitar 30 menit. Paparan bakalan nyebabin inaktivasi QA (mungkin ngurangin QA sekali atau dua kali). Tapi tolong dicatet kalo proses ini bisa dibalikin karena setelah periode lama adaptasi gelap, RC bakal perlahan balik ke aktivitas QA. Spektrometer Helios (Ultrafast Systems, USA) dipake buat ngukur spektrum transien dengan waktu penundaan -10 sampe 7000 ps. Pake perangkat lunak Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) buat ngebongkar kumpulan data, trus nyatuin dan standarisasi. Pake paket perangkat lunak CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) buat make set data gabungan buat dapetin spektrum diferensial yang terkait dengan peluruhan, atau pake fungsi yang ngelindungin beberapa eksponen dengan respon instrumen buat ngecocokin evolusi spektral panjang gelombang tunggal di Origin (OriginLab, USA).
Seperti yang udah disebutin di atas (53), film fotosintesis yang mengandung kompleks LH1 yang kagak punya antena RC dan LH2 tepi disiapkan. Membran diencerkan dalam 20 mM tris (pH 8.0) dan kemudian dimuat ke dalam kuvet kuarsa dengan jalur optik 2 mm. Pulsa laser 30nJ dipake buat ngebuat sampel di 540 nm dengan waktu penundaan -10 sampe 7000 ps. Olah set data seperti yang dijelaskan untuk Rps. sampel temen.
Membran dipelet dengan sentrifugasi pada 150,000 RCF selama 2 jam pada 4°C, dan kemudian absorbansinya pada 880 nm disuspensikan kembali dalam 20 mM tris-HCl (pH 8,0) dan 200 mM NaCl. Larutin membran dengan cara ngaduk pelan-pelan 2% (w/v) β-DDM selama 1 jam di gelap pada suhu 4°C. Sampel diencerkan dalam 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) hingga konsentrasi protein 2.5 mg ml-1 (analisis Bio-Rad). Pemrosesan lebih lanjut dilakukan dari metode yang dipublikasikan sebelumnya (54), dimulai dengan pengenceran 50 μg protein menjadi total 50 μl TEAB yang mengandung 1% (w/v) natrium laurat (Merck, Inggris). Setelah sonikasi selama 60 detik, itu dikurangi dengan 5 mM tris (2-karboksietil) fosfin (Merck, Inggris) pada suhu 37 ° C selama 30 menit. Buat S-alkilasi, inkubasi sampel dengan 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) dan tambahkan dari larutan stok isopropanol 200 mM selama 10 menit pada suhu kamar. Pencernaan proteolitik dilakukan dengan menambahkan 2 μg campuran trypsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 3 jam. Surfaktan laurat diekstraksi dengan menambahkan 50 μl etil asetat dan 10 μl 10% (v/v) asam trifluoroasetat kelas LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) dan vortexing selama 60 detik. Pemisahan fase dipromosikan dengan sentrifugasi pada 15.700 RCF selama 5 menit. Menurut protokol pabrikan, kolom spin C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) digunain buat ngaspirasi dan ngilangin garam fase bawah yang mengandung peptida dengan hati-hati. Setelah dijemur dengan sentrifugasi vakum, sampel dilarutkan dalam 0,5% TFA dan 3% asetonitril, dan 500 ng dianalisis dengan kromatografi nanoflow RP digabungkan dengan spektrometri massa menggunakan parameter sistem yang dirinci sebelumnya.
Pake MaxQuant v.1.5.3.30 (56) buat identifikasi dan kuantifikasi protein buat nyari Rps. database proteom palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Data proteomik spektrometri massa udah disimpen di ProteomeXchange Alliance lewat repositori mitra PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) di bawah pengidentifikasi dataset PXD020402.
Untuk analisis dengan RPLC digabungkan dengan spektrometri massa ionisasi elektrospray, kompleks RC-LH1 disiapkan dari Rps tipe liar. Pake metode yang udah dipublikasiin sebelumnya (16), konsentrasi protein yang dihasilin di sel palustris adalah 2 mg ml-1 dalam 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl dan 0,03% (w/v) β- (analisis Bio-Rad) ) DDM. Menurut protokol pabrikan, pake kit pemurnian 2D (GE Healthcare, USA) buat ngekstrak 10 μg protein dengan metode presipitasi, dan larutin endapan di 20 μl 60% (v / v) asam formik (FA), 20% (v / v) Acetonitrile dan 20% (v / v) air. Lima mikroliter dianalisis dengan RPLC (Dionex RSLC) ditambah dengan spektrometri massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Pake kolom MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) buat pemisahan di 60°C dan 100μlmin -1, dengan gradien 85% (v/v) pelarut A [0.1% (v/v) FA dan 0.02% (V/v) TFA larutan berair] ke pelarut 5%/v/v) [0.1%(v/v) FA dan 0.02%(v/v) di 90%(v/v) asetonitril TFA] Pake sumber ionisasi elektrospray standar dan parameter bawaan selama lebih dari 60 menit, spektrometer massa dapetin 100 sampe 2750 m/z (rasio muatan massa). Dengan bantuan portal sumber daya bioinformatika ExPASy alat FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), petakan spektrum massa ke subunit kompleks.
Sel-sel ditumbuhin selama 72 jam di bawah 100 ml NF-rendah (10μMm-2 s-1), sedang (30μMm-2 s-1) atau tinggi (300μMm-2 s-1) cahaya. Media M22 (media M22 di mana amonium sulfat dihilangkan dan natrium suksinat diganti dengan natrium asetat) dalam botol sekrup 100 ml (23). Dalam lima siklus 30-s, manik-manik kaca 0,1 mikron dimanik-manik pada rasio volume 1:1 untuk melisis sel dan didinginkan di atas es selama 5 menit. Bahan yang kagak larut, sel yang kagak pecah dan manik-manik kaca diilangin dengan sentrifugasi di 16.000 RCF selama 10 menit di mikrosentrifuga meja. Membran dipisahin di rotor Ti 70.1 dengan 100.000 RCF di 20 mM tris-HCl (pH 8.0) dengan gradien sukrosa 40/15% (w/w) selama 10 jam.
Seperti yang dijelasin di kerjaan kite sebelumnya, imunodeteksi tag His di PufW (16). Singkatnya, kompleks inti yang dimurnikan (11,8 nM) atau membran yang mengandung konsentrasi RC yang sama (ditentukan dengan oksidasi mengurangi spektrum perbedaan yang berkurang dan mencocokkan beban pada gel yang diwarnai) dalam penyangga pemuatan 2x SDS (Merck, Inggris) diencerkan dua kali. Protein dipisahin di replika 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Sebuah gel diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Inggris) untuk memuat dan memvisualisasikan subunit RC-L. Protein di gel kedua ditransfer ke membran poliviniliden fluorida yang diaktifin metanol (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, UK) untuk imunoassay. Membran PVDF diblokir di 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 dan 5% (w/v) susu bubuk skim, dan kemudian diinkubasi dengan antibodi primer anti-His (dalam penyangga antibodi encer [50 mM-HCl) 7.6), 150 mM NaCl dan 0.05% (v/v) Tween-20] di 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) selama 4 jam. Setelah dicuci 3 kali selama 5 menit di penyangga antibodi, membran dikombinasikan dengan antibodi sekunder anti-tikus horseradish peroksidase (Sigma-Aldrich, Inggris) (diencerin 1:10,000 di penyangga antibodi) Inkubasi untuk memungkinkan deteksi (5 menit setelah 3 pencucian di penyangga antibodi) menggunakan WAR EST 2000. substrat chemiluminescence (Cyanagen, Italia) dan Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Dengan menggambar distribusi intensitas dari setiap gel diwarnai atau jalur imunoassay, mengintegrasikan area di bawah puncak dan menghitung rasio intensitas RC-L (gel diwarnai) dan Protein-W (immunoassay), di ImageJ (57) Proses gambar. Rasio-rasio ini diubah jadi rasio molar dengan berasumsi bahwa rasio RC-L ke protein-W dalam sampel RC-LH114-W murni adalah 1:1 dan menormalkan seluruh set data sesuai.
Buat bahan tambahan buat artikel ini, tolong liat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Atribusi Creative Commons. Artikel ini memungkinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batasan di media apa pun dengan kondisi bahwa karya aslinya dikutip dengan benar.
Catatan: Kita cuma minta lu buat ngasih alamat email lu biar orang yang lu rekomendasiin ke halaman tau kalo lu pengen mereka ngeliat emailnya dan kalo itu bukan spam. Kita kagak bakalan ngambil alamat email.
Pertanyaan ini dipake buat ngetes apakah lu pengunjung dan mencegah pengiriman spam otomatis.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Hicoil Necoil, Necoilter.
Struktur resolusi tinggi dari kompleks perangkap cahaya 1 di pusat reaksi memberikan wawasan baru tentang dinamika quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Hicoil Necoil, Necoilter.
Struktur resolusi tinggi dari kompleks perangkap cahaya 1 di pusat reaksi memberikan wawasan baru tentang dinamika quinone.
©2021 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. semua hak dilindungi. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.