Sekarang *Alamat saat ini: Cologne 50931, Jerman, Penelitian Klaster Keunggulan Cologne pada Respon Stres Seluler dalam Penyakit Terkait Penuaan (CECAD).
Neurodegenerasi penyakit mitokondria dianggap kagak bisa dibalikin karena plastisitas metabolisme neuron terbatas, tapi efek disfungsi mitokondria pada otonomi sel metabolisme neuron di tubuh kurang dipahami. Di sini, kite ngenalin proteom spesifik sel dari neuron Purkinje dengan defisiensi OXPHOS progresif yang disebabkan oleh dinamika fusi mitokondria yang terganggu. Kita nemuin kalo disfungsi mitokondria memicu perubahan mendalam di bidang proteomik, yang akhirnya mengarah ke aktivasi berurutan program metabolisme yang tepat sebelum kematian sel. Gak disangka, kite nentuin induksi yang jelas dari piruvat karboksilase (PCx) dan enzim anti-penuaan laennye yang melengkapi perantara siklus TCA. Penghambatan PCx memperparah stres oksidatif dan neurodegenerasi, yang nunjukin kalo aterosklerosis punya efek pelindung pada neuron yang kagak punya OXPHOS. Pemulihan fusi mitokondria di neuron yang degenerasi terminal benar-benar membalikkan karakteristik metabolisme ini, sehingga mencegah kematian sel. Temuan kite identifikasi jalur yang sebelumnya kagak diketahui yang ngasih ketahanan terhadap disfungsi mitokondria dan nunjukin kalo neurodegenerasi bisa dibalikin bahkan di tahap akhir penyakit.
Peran sentral mitokondria dalam mempertahankan metabolisme energi neuron ditekankan oleh gejala neurologis yang luas yang terkait dengan penyakit mitokondria manusia. Kebanyakan dari penyakit ini disebabkan oleh mutasi gen yang mengatur ekspresi gen mitokondria (1, 2) atau kehancuran gen yang terkait dengan dinamika mitokondria, yang secara tidak langsung mempengaruhi stabilitas DNA mitokondria (mtDNA) (3, 4). Kerjaan di model hewan telah menunjukkan bahwa sebagai respon terhadap disfungsi mitokondria di jaringan sekitar, jalur metabolisme konservatif (5-7) dapat diaktifkan, yang memberikan informasi penting untuk pemahaman mendalam tentang patogenesis penyakit kompleks ini. Sebaliknya, pemahaman kita tentang perubahan metabolisme jenis sel tertentu yang disebabkan oleh kegagalan umum produksi adenosin trifosfat (ATP) mitokondria otak adalah mendasar (8), menekankan perlunya mengidentifikasi target terapeutik yang dapat digunakan untuk mencegah atau mencegah penyakit. Cegah neurodegenerasi (9). Kurangnya informasi adalah fakta bahwa sel saraf secara luas dianggap memiliki fleksibilitas metabolisme yang sangat terbatas dibandingkan dengan jenis sel jaringan sekitarnya (10). Mengingat bahwa sel-sel ini memainkan peran sentral dalam mengkoordinasikan pasokan metabolit ke neuron untuk mempromosikan transmisi sinaptik dan merespon kondisi cedera dan penyakit, kemampuan untuk beradaptasi metabolisme sel terhadap kondisi jaringan otak yang menantang hampir terbatas pada sel glial (11-14). Selain itu, heterogenitas seluler yang melekat pada jaringan otak sebagian besar menghambat studi perubahan metabolisme yang terjadi pada subkelompok neuron tertentu. Alhasil, sedikit yang diketahui tentang konsekuensi seluler dan metabolisme yang tepat dari disfungsi mitokondria pada neuron.
Untuk memahami konsekuensi metabolisme dari disfungsi mitokondria, kami mengisolasi neuron Purkinje (PN) dalam berbagai tahap neurodegenerasi yang disebabkan oleh kehancuran fusi membran luar mitokondria (Mfn2). Meskipun mutasi Mfn2 pada manusia terkait dengan bentuk neuropati sensorik motorik turun-temurun yang dikenal sebagai Charcot-Marie-Tooth tipe 2A (15), penghancuran kondisional Mfn2 pada tikus adalah metode disfungsi induksi oksidasi Fosforilasi (OXPHOS) yang diakui dengan baik. Berbagai subtipe neuronal (16-19) dan fenotipe neurodegeneratif yang dihasilkan disertai oleh gejala neurologis progresif, seperti gangguan gerak (18, 19) atau ataksia serebelum (16). Dengan make kombinasi proteomik kuantitatif bebas label (LFQ), metabolomik, pencitraan, dan metode virologis, kite nunjukin kalo neurodegenerasi progresif sangat menginduksi piruvat karboksilase (PCx) dan faktor-faktor laen yang terlibat dalam arteriosklerosis PN in vivo Ekspresi enzim. Buat ngeverifikasi relevansi temuan ini, kite secara spesifik ngatur ekspresi PCx di PN yang kekurangan Mfn2, dan nemuin kalo operasi ini memperparah stres oksidatif dan mempercepat neurodegenerasi, sehingga membuktikan bahwa azoospermia memberikan kematian sel Kemampuan adaptasi metabolisme. Ekspresi parah dari MFN2 dapat sepenuhnya menyelamatkan degenerasi terminal PN dengan defisiensi OXPHOS parah, konsumsi DNA mitokondria yang besar-besaran, dan jaringan mitokondria yang rupanya rusak, yang lebih menekankan bahwa bentuk neurodegenerasi ini bahkan dapat pulih pada tahap lanjut penyakit sebelum kematian sel.
Untuk memvisualisasikan mitokondria di Mfn2 knockout PNs, kami menggunakan strain tikus yang memungkinkan mitokondria yang bergantung pada Cre untuk menargetkan ekspresi Cre protein fluoresen kuning (YFP) (mtYFP) (20) dan memeriksa morfologi mitokondria in vivo. Kita nemuin kalo penghancuran gen Mfn2 di PN bakalan mengarah ke pembelahan bertahap dari jaringan mitokondria (Gambar S1A), dan perubahan paling awal ditemukan pada usia 3 minggu. Sebaliknya, degenerasi substansial dari lapisan sel PN, seperti yang dibuktikan oleh hilangnya imunostaining Calbindin, tidak dimulai sampai usia 12 minggu (Gambar 1, A dan B). Ketidakcocokan waktu antara perubahan paling awal dalam morfologi mitokondria dan onset kematian neuron yang terlihat mendorong kami untuk menyelidiki perubahan metabolisme yang dipicu oleh disfungsi mitokondria sebelum kematian sel. Kita ngembangin strategi berbasis fluoresensi-activated cell sorting (FACS) buat ngisolasi PN yang mengekspresikan YFP (YFP+) (Gambar 1C), dan di tikus kontrol (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), selanjutnya disebut sebagai CTRL (Gambar S1B). Optimasi strategi gating berdasarkan intensitas relatif sinyal YFP memungkinkan kite untuk memurnikan badan YFP+ (YFPhigh) dari PN dari non-PN (YFPneg) (Gambar S1B) atau fragmen akson/dendritik neon yang diduga (YFPlow; Gambar S1D, kiri), yang dikonfirmasi oleh mikroskop konfokal (Gambar S1D, kanan). Untuk memverifikasi identitas populasi yang diklasifikasikan, kami melakukan proteomik LFQ dan kemudian analisis komponen utama, dan menemukan bahwa ada pemisahan yang jelas antara sel YFPhigh dan YFPneg (Gambar S1C). Sel YFPhigh nunjukin pengayaan bersih dari penanda PNs yang diketahui (yaitu Calb1, Pcp2, Grid2 dan Itpr3) (21, 22), tapi kagak ada pengayaan protein yang biasa diekspresikan di neuron atau jenis sel laen (Gambar 1D) ). Perbandingan antara sampel di sel YFPhigh yang diklasifikasikan yang dikumpulkan dalam percobaan independen menunjukkan koefisien korelasi> 0,9, menunjukkan reproduksi yang baik antara replikasi biologis (Gambar S1E). Kesimpulannye, data ini ngevalidasi rencana kite buat isolasi akut dan spesifik dari PN yang layak. Karena sistem driver L7-cre yang dipake menginduksi rekombinasi mosaik di minggu pertama setelah persalinan (23), kite mulai ngebunuh tikus dari CTRL dan kondisional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kumpulin neuron. Setelah rekombinasi selesai, itu disebut Mfn2cKO pada usia 4 minggu. Sebagai titik akhir, kite milih 8 minggu umur pas lapisan PN utuh meskipun fragmentasi mitokondria yang jelas (Gambar 1B dan Gambar S1A). Secara total, kite ngukur total 3013 protein, yang sekitar 22% didasarkan pada anotasi MitoCarta 2.0 berdasarkan proteom mitokondria sebagai mitokondria (Gambar 1E) (Gambar 1E) (24). Analisis ekspresi gen diferensial yang dilakukan pada minggu ke-8 menunjukkan bahwa hanya 10,5% dari semua protein yang memiliki perubahan yang signifikan (Gambar 1F dan Gambar S1F), di mana 195 protein diatur ke bawah dan 120 protein diatur ke atas (Gambar 1F). Perlu dicatet kalo "analisis jalur inovatif" dari kumpulan data ini nunjukin kalo gen yang diekspresikan secara berbeda terutama termasuk dalam kumpulan jalur metabolisme spesifik yang terbatas (Gambar 1G). Menariknya, meskipun penurunan regulasi jalur yang terkait dengan OXPHOS dan pensinyalan kalsium mengkonfirmasi induksi disfungsi mitokondria pada PN yang kekurangan fusi, kategori lain yang terutama melibatkan metabolisme asam amino secara signifikan diatur ke atas, yang sejalan dengan metabolisme yang terjadi di mitokondria PN yang konsisten. gangguan fungsi.
(A) Foto konfokal representatif dari bagian serebelum tikus CTRL dan Mfn2cKO yang nunjukin hilangnya PN progresif (calbindin, abu-abu); inti diwarnai dengan DAPI. (B) Kuantifikasi dari (A) (analisis varians satu arah, ***P<0.001; n = 4 sampai 6 lingkaran dari tiga tikus). (C) Alur kerja eksperimental. (D) Distribusi peta panas penanda spesifik Purkinje (atas) dan jenis sel lain (tengah). (E) Diagram Venn yang nunjukin jumlah protein mitokondria yang diidentifikasi di PN yang diklasifikasiin. (F) Plot gunung berapi dari protein yang diekspresikan secara berbeda di neuron Mfn2cKO pada 8 minggu (nilai cut-off signifikansi 1,3). (G) Analisis jalur kreativitas nunjukin lima jalur up-regulasi (merah) dan down-regulasi (biru) paling penting di Mfn2cKO PN yang diklasifikasiin sebagai 8 minggu. Tingkat ekspresi rata-rata dari setiap protein yang terdeteksi ditunjukin. Peta panas skala abu-abu: nilai P yang disesuaikan. ns, kagak penting.
Data proteomik nunjukin kalo ekspresi protein kompleks I, III, dan IV berangsur-angsur menurun. Kompleks I, III, dan IV semua mengandung subunit yang dikodekan mtDNA esensial, sementara kompleks II, yang hanya dikodekan nuklir, pada dasarnya tidak terpengaruh (Gambar 2A dan Gambar S2A). . Konsisten dengan hasil proteomik, imunohistokimia bagian jaringan serebelum menunjukkan bahwa MTCO1 (mitokondria sitokrom C oksidase subunit 1) tingkat subunit kompleks IV di PN secara bertahap menurun (Gambar 2B). Subunit Mtatp8 yang dikodekan mtDNA secara signifikan berkurang (Gambar S2A), sementara tingkat steady-state dari subunit ATP sintase yang dikodekan nuklir tetep kagak berubah, yang konsisten dengan kompleks subrakitan ATP sintase F1 yang stabil yang diketahui ketika ekspresi mtDNA stabil. Formasinya konsisten. Sela (7). Evaluasi tingkat mtDNA di Mfn2cKO PNs yang diurutin dengan reaksi berantai polimerase waktu nyata (qPCR) mengkonfirmasi penurunan bertahap dalam jumlah salinan mtDNA. Dibandingin ama kelompok kontrol, di umur 8 minggu, cuma sekitar 20% dari kadar mtDNA yang dipertahankan (Gambar 2C). Konsisten dengan hasil ini, pewarnaan mikroskop konfokal Mfn2cKO PNs digunakan untuk mendeteksi DNA, menunjukkan konsumsi nukleotida mitokondria yang bergantung pada waktu (Gambar 2D). Kita nemuin kalo cuma beberapa kandidat yang terlibat dalam degradasi protein mitokondria dan respon stres yang diatur, termasuk Lonp1, Afg3l2 dan Clpx, dan faktor perakitan kompleks OXPHOS. Gak ada perubahan signifikan dalam tingkat protein yang terlibat dalam apoptosis yang terdeteksi (Gambar S2B). Sama, kite nemuin kalo mitokondria dan saluran retikulum endoplasma yang terlibat dalam transportasi kalsium cuma punya perubahan kecil (Gambar S2C). Selain itu, evaluasi protein terkait autofagi kagak nemuin perubahan yang signifikan, yang konsisten dengan induksi autofagosom yang keliatan yang diamati in vivo oleh imunohistokimia dan mikroskop elektron (Gambar S3). Namun, disfungsi OXPHOS progresif di PN disertai dengan perubahan mitokondria ultrastruktural yang jelas. Gugusan mitokondria bisa diliat di badan sel dan pohon dendritik Mfn2cKO PN berusia 5 dan 8 minggu, dan struktur membran dalam telah mengalami perubahan mendalam (Gambar S4, A dan B). Konsisten dengan perubahan ultrastruktural ini dan penurunan mtDNA yang signifikan, analisis irisan serebelum akut dengan ester metil tetramethylrhodamine (TMRM) menunjukkan bahwa potensi membran mitokondria di Mfn2cKO PNs menurun secara signifikan (Gambar S4C).
(A) Analisis perjalanan waktu tingkat ekspresi kompleks OXPHOS. Cuma pertimbangin protein dengan P<0.05 di 8 minggu (ANOVA dua arah). Garis putus-putus: Gak ada penyesuaian dibandingin ama CTRL. (B) Kiri: Contoh bagian serebelum yang dilabelin dengan antibodi anti-MTCO1 (bar skala, 20 μm). Area yang ditempati oleh badan sel Purkinje ditutupi oleh warna kuning. Kanan: Kuantifikasi kadar MTCO1 (analisis varians satu arah; n = 7 hingga 20 sel dianalisis dari tiga tikus). (C) analisis qPCR dari nomor salinan mtDNA di PN yang diurutin (analisis varians satu arah; n = 3 sampe 7 tikus). (D) Kiri: Contoh irisan serebelum yang dilabelin dengan antibodi anti-DNA (bar skala, 20 μm). Area yang ditempati oleh badan sel Purkinje ditutupi oleh warna kuning. Kanan: Kuantifikasi lesi mtDNA (analisis varians satu arah; n = 5 hingga 9 sel dari tiga tikus). (E) Contoh bagian serebelum akut yang nunjukin sel mitoYFP + Purkinje (panah) dalam rekaman penjepit tambalan sel utuh. (F) Pengukuran kurva IV. (G) Rekaman representatif dari injeksi arus depolarisasi di sel CTRL dan Mfn2cKO Purkinje. Jejak atas: Detak pertama yang memicu AP. Jejak bawah: Frekuensi AP maksimum. (H) Kuantifikasi masukan spontan postsinaptik (sPSPs). Jejak rekaman representatif dan rasio zoomnya ditunjukin di (I). Analisis varians satu arah menganalisis n = 5 hingga 20 sel dari tiga tikus. Data dinyatakan sebagai rata-rata±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Jejak representatif dari AP spontan yang direkam menggunakan mode penjepit tambalan berlubang. Jejak atas: Frekuensi AP maksimum. Jejak bawah: zoom dari satu AP. (K) Ukur frekuensi AP rata-rata dan maksimum sesuai (J). tes Mann-Whitney; n = 5 sel dianalisis dari empat tikus. Data dinyatakan sebagai rata-rata±SEM; kagak penting.
Kerusakan OXPHOS yang jelas terdeteksi pada Mfn2cKO PN berusia 8 minggu, yang menunjukkan bahwa fungsi fisiologis neuron sangat abnormal. Oleh karena itu, kite nganalisis karakteristik listrik pasif dari neuron yang kekurangan OXPHOS pada 4 sampe 5 minggu dan 7 sampe 8 minggu dengan ngelakuin rekaman penjepit tambal seluruh sel di irisan serebelum akut (Gambar 2E). Gak disangka, potensi membran istirahat rata-rata dan resistensi masukan neuron Mfn2cKO mirip dengan kontrol, meskipun ada perbedaan halus antar sel (Tabel 1). Sama, di umur 4 sampe 5 minggu, kagak ada perubahan yang signifikan dalam hubungan arus-tegangan (kurva IV) yang ditemuin (Gambar 2F). Namun, kagak ada neuron Mfn2cKO 7 sampe 8 minggu yang bertahan dari rejimen IV (langkah hiperpolarisasi), yang nunjukin kalo ada sensitivitas yang jelas terhadap potensi hiperpolarisasi di tahap akhir ini. Sebaliknya, di neuron Mfn2cKO, arus depolarisasi yang menyebabkan debit potensial aksi berulang (AP) ditoleransi dengan baik, menunjukkan bahwa pola debit keseluruhan mereka tidak berbeda secara signifikan dari neuron kontrol berusia 8 minggu (Tabel 1 dan Gambar 2G). Sama, frekuensi dan amplitudo arus postsinaptik spontan (sPSC) sebanding dengan kelompok kontrol, dan frekuensi kejadian meningkat dari 4 minggu ke 5 minggu ke 7 minggu ke 8 minggu dengan peningkatan yang sama (Gambar 2, H dan I). Periode pematangan sinaptik di PN (25). Hasil yang sama didapet setelah tambalan PNs berlubang. Konfigurasi ini mencegah kemungkinan kompensasi cacat ATP seluler, seperti yang mungkin terjadi dalam rekaman penjepit tambal seluruh sel. Secara khusus, potensial membran istirahat dan frekuensi penembakan spontan neuron Mfn2cKO kagak terpengaruh (Gambar 2, J dan K). Kesimpulannye, hasil ini nunjukin kalo PN dengan disfungsi OXPHOS yang jelas bisa ngadepin pola debit frekuensi tinggi dengan baik, nunjukin kalo ada mekanisme kompensasi yang memungkinkan mereka buat mempertahankan respon elektrofisiologis yang hampir normal.
Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM (analisis varians satu arah, tes perbandingan ganda Holm-Sidak; *P<0.05). Nomor satuan ditunjukkan dengan kurung.
Kita mulai buat nyelidikin apakah ada kategori di dataset proteomik (Gambar 1G) termasuk jalur yang bisa ngelawan defisiensi OXPHOS yang parah, sehingga menjelaskan kenapa PN yang terkena dapat mempertahankan elektrofisiologi yang hampir normal (Gambar 2, E hingga K). . Analisis proteomik nunjukin kalo enzim yang terlibat dalam katabolisme asam amino berantai bercabang (BCAA) secara signifikan diatur ke atas (Gambar 3A dan Gambar S5A), dan produk akhir asetil-CoA (CoA) atau suksinil CoA dapat melengkapi trikarboksilat dalam siklus Asam arteriosklerosis (TCA). Kita nemuin kalo kandungan BCAA transaminase 1 (BCAT1) dan BCAT2 sama-sama meningkat. Mereka mengkatalisis langkah pertama katabolisme BCAA dengan menghasilkan glutamat dari α-ketoglutarate (26). Semua subunit yang membentuk kompleks keto asam dehidrogenase (BCKD) rantai bercabang diatur ke atas (kompleks mengkatalisis dekarboksilasi selanjutnya dan irreversibel dari kerangka karbon BCAA yang dihasilkan) (Gambar 3A dan Gambar S5A). Namun, kagak ada perubahan yang jelas di BCAA sendiri yang ditemuin di PN yang diurutin, yang mungkin disebabkan oleh peningkatan pengambilan seluler asam amino esensial ini atau penggunaan sumber lain (glukosa atau asam laktat) untuk melengkapi siklus TCA (Gambar S5B). PN yang kagak punya OXPHOS juga nunjukin peningkatan aktivitas dekomposisi glutamin dan transaminasi pada usia 8 minggu, yang dapat dicerminkan oleh peningkatan enzim mitokondria glutaminase (GLS) dan glutamin piruvat transaminase 2 (GPT2) (Gambar 3, A dan C). Perlu dicatet kalo peningkatan GLS terbatas pada isoform glutaminase C yang disambung (GLS-GAC) (perubahan Mfn2cKO/CTRL sekitar 4,5 kali lipat, P = 0,05), dan peningkatan spesifiknya di jaringan kanker Bisa mendukung bioenergi mitokondria. (27).
(A) Peta panas nunjukin perubahan lipatan tingkat protein untuk rute yang ditentukan pada 8 minggu. (B) Contoh irisan serebelum yang dilabelin dengan antibodi anti-PCx (bar skala, 20 μm). Panah kuning nunjuk ke badan sel Purkinje. (C) Analisis ekspresi protein perjalanan waktu diidentifikasi sebagai kandidat penting untuk aterosklerosis (uji t ganda, *FDR <5%; n = 3-5 tikus). (D) Di atas: Diagram skematik yang nunjukin cara yang berbeda buat masukin karbon berlabel yang ada di [1-13C] pelacak piruvat (yaitu, lewat PDH atau rute trans-arteri). Bawah: Bagan biola nunjukin persentase karbon berlabel tunggal (M1) yang diubah jadi asam aspartat, asam sitrat dan asam malat setelah ngelabelin irisan serebelum akut dengan [1-13C] piruvat (uji t berpasangan; ** P <0,01). (E) Analisis sejarah waktu komprehensif dari jalur yang ditunjukkan. Cuma pertimbangin protein dengan P<0.05 di 8 minggu. Garis putus-putus: kagak ada nilai penyesuaian (analisis varians dua arah; * P <0,05; *** P <0,001). Data dinyatakan sebagai rata-rata±SEM.
Dalam analisis kite, katabolisme BCAA udah jadi salah satu jalur peningkatan kunci. Fakta ini sangat menunjukkan bahwa volume ventilasi yang masuk ke siklus TCA dapat berubah di PN yang kurang OXPHOS. Ini mungkin mewakili bentuk utama dari pengkabelan ulang metabolisme neuron, yang mungkin memiliki dampak langsung pada fisiologi neuron dan kelangsungan hidup selama pemeliharaan disfungsi OXPHOS yang parah. Konsisten dengan hipotesis ini, kite nemuin kalo enzim anti-aterosklerotik utama PCx diatur ke atas (Mfn2cKO/CTRL berubah sekitar 1,5 kali; Gambar 3A), yang mengkatalisis konversi piruvat ke oksaloasetat (28), yang dipercaya dalam ekspresi jaringan otak terbatas untuk astrosis (29, 30). Konsisten dengan hasil proteomik, mikroskop konfokal nunjukin kalo ekspresi PCx secara spesifik dan signifikan meningkat di PN yang kekurangan OXPHOS, sementara reaktivitas PCx terutama dibatasi ke sel glial Bergmann yang berdekatan dari kontrol (Gambar 3B). Buat ngetes secara fungsional peningkatan PCx yang diamati, kite ngerawat irisan serebelum akut dengan [1-13C] pelacak piruvat. Pas piruvat dioksidasi oleh piruvat dehidrogenase (PDH), label isotopnya ilang, tapi dimasukin ke perantara siklus TCA pas piruvat dimetabolisme oleh reaksi vaskular (Gambar 3D). Untuk mendukung data proteomik kami, kami mengamati sejumlah besar penanda dari pelacak ini di asam aspartat dari irisan Mfn2cKO, sementara asam sitrat dan asam malat juga memiliki tren moderat, meskipun tidak signifikan (Gambar 3D).
Di neuron dopamin tikus MitoPark dengan disfungsi mitokondria yang disebabkan oleh neuron dopamin yang secara spesifik menghancurkan gen faktor transkripsi mitokondria A (Tfam) (Gambar S6B), ekspresi PCx juga secara signifikan diatur ke atas (31), menunjukkan bahwa arteriosklerosis asam aseton Kejadian penyakit diatur selama gangguan fungsi neuron OXPHOS di badan. Perlu dicatet kalo udah ditemuin kalo enzim unik (32-34) yang mungkin diekspresikan di neuron yang mungkin terkait dengan arteriosklerosis secara signifikan diatur ke atas di PN yang kurang OXPHOS, seperti propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA mengubah propionyl-CoA-CoA mitoconyl dan suksis enzim 3 (ME3), yang peran utamanya adalah untuk memulihkan piruvat dari malat (Gambar 3, A dan C) (33, 35). Selain itu, kite nemuin peningkatan yang signifikan di enzim Pdk3, yang ngefosforilasi dan dengan demikian menonaktifkan PDH (36), sementara kagak ada perubahan yang terdeteksi di enzim Pdp1 yang ngaktifin PDH atau kompleks enzim PDH itu sendiri (Gambar 3A). Secara konsisten, di Mern2cKO PNs, fosforilasi subunit α1 α (PDHE1α) dari komponen piruvat dehidrogenase E1 dari kompleks PDH di Ser293 (yang diketahui menghambat aktivitas enzim PDH) ditingkatkan (Gambar S6C) (Gambar S6C). Piruvat kagak punya akses pembuluh darah.
Akhirnya, kite nemuin kalo jalur super biosintesis serin dan glisin, siklus folat mitokondria (1C) terkait dan biosintesis prolin (Gambar 1G dan Gambar S5C) semuanya diatur secara signifikan, menurut laporan, selama proses aktivasi. Jaringan sekitarnya diaktifin dengan disfungsi mitokondria (5-7). Analisis konfokal yang mendukung data proteomik ini nunjukin kalo di PN dengan OXPHOS yang hilang, irisan serebelum tikus berusia 8 minggu dikenain serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), enzim kunci siklus folat mitokondria. Respon imun yang signifikan (Gambar S5D). Di 13 irisan serebelum akut yang diinkubasi CU-glukosa, percobaan pelacakan metabolisme lebih lanjut mengkonfirmasi peningkatan biosintesis serin dan prolin, yang menunjukkan bahwa fluks isoform karbon ke dalam serin dan prolin meningkat (Gambar S5E). Karena reaksi yang dipromosikan oleh GLS dan GPT2 bertanggung jawab atas sintesis glutamat dari glutamin dan transaminasi antara glutamat dan α-ketoglutarat, peningkatan mereka menunjukkan bahwa neuron yang kekurangan OXPHOS memiliki peningkatan permintaan untuk glutamat, Ini mungkin bertujuan untuk mempertahankan peningkatan biosintesis proline (Gambar S5). Berbeda dengan perubahan ini, analisis proteomik astrosit serebelum dari tikus Mfn2cKO spesifik PN menunjukkan bahwa jalur-jalur ini (termasuk semua antiperoksidase) tidak berubah secara signifikan dalam ekspresi, sehingga menunjukkan Pengalihan metabolisme ini selektif terhadap PN yang terdegradasi (Gambar S6, D hingga G).
Kesimpulannye, analisis ini nunjukin pola aktivasi temporal yang beda banget dari jalur metabolisme spesifik di PN. Meskipun fungsi mitokondria neuronal yang abnormal dapat menyebabkan aterosklerosis dini dan remodeling 1C (Gambar 3E dan Gambar S5C), dan bahkan perubahan yang dapat diprediksi dalam ekspresi kompleks I dan IV, perubahan dalam sintesis serin de novo hanyalah. Cuma keliatan di tahap akhir. Disfungsi OXPHOS (Gambar 3E dan Gambar S5C). Temuan ini mendefinisikan proses berurutan di mana respon mitokondria (siklus 1C) dan sitoplasma (biosintesis serin) yang diinduksi stres secara sinergis dengan peningkatan aterosklerosis dalam siklus TCA untuk membentuk kembali metabolisme neuron.
PN yang kekurangan OXPHOS umur 8 minggu dapat mempertahankan aktivitas eksitasi frekuensi tinggi dan mengalami rekoneksi metabolisme yang signifikan untuk mengkompensasi disfungsi mitokondria. Penemuan ini menimbulkan kemungkinan menarik bahwa bahkan saat ini, sel-sel ini juga mungkin menerima intervensi terapeutik untuk menunda atau mencegah neurodegenerasi. Empel. Kita nyelesain kemungkinan ini lewat dua intervensi independen. Di metode pertama, kite ngerancang vektor virus terkait adeno (AAV) yang bergantung pada Cre sehingga MFN2 dapat diekspresikan secara selektif dalam PN yang kekurangan OXPHOS in vivo (Gambar S7A). AAV yang ngekode MFN2 dan gen reporter fluoresen mCherry (Mfn2-AAV) diverifikasi di kultur neuron primer in vitro, yang menyebabkan MFN2 diekspresikan dengan cara yang bergantung pada Cre dan menyelamatkan morfologi mitokondria, sehingga mencegah neuromutasi di neuron Mfn2cKO (Gambar S7, D, B, D). Berikutnye, kite ngelakuin percobaan in vivo buat nganterin Mfn2-AAV 8 minggu secara stereotaktik ke korteks serebelum Mfn2cKO dan tikus kontrol, dan nganalisis tikus 12 minggu (Gambar 4A). Tikus Mfn2cKO yang diobati mati (Gambar 1, A dan B) (16). Transduksi virus in vivo menghasilkan ekspresi selektif PN di beberapa lingkaran serebelum (Gambar S7, G dan H). Suntikan AAV kontrol yang cuma mengekspresikan mCherry (Ctrl-AAV) kagak punya efek yang signifikan pada tingkat neurodegenerasi pada hewan Mfn2cKO. Sebaliknya, analisis Mfn2cKO yang ditransduksi dengan Mfn2-AAV nunjukin efek pelindung yang signifikan dari lapisan sel PN (Gambar 4, B dan C). Secara khusus, kepadatan neuron tampaknya hampir tidak dapat dibedakan dari hewan kontrol (Gambar 4, B dan C, dan Gambar S7, H dan I). Ekspresi MFN1 tapi bukan MFN2 sama-sama efektif dalam menyelamatkan kematian neuron (Gambar 4C dan Gambar S7, C dan F), yang menunjukkan bahwa ekspresi MFN1 ektopik secara efektif dapat melengkapi kurangnya MFN2. Analisis lebih lanjut di tingkat PN tunggal nunjukin kalo Mfn2-AAV sebagian besar nyelametin ultrastruktur mitokondria, menormalkan tingkat mtDNA, dan ngebalikin ekspresi tinggi penanda anti-angiogenesis PCx (Gambar 4, C sampe E). Pemeriksaan visual dari tikus Mfn2cKO yang diselamatin dalam keadaan istirahat menunjukkan bahwa postur dan gejala motorik mereka (gerakan S1 hingga S3) meningkat. Kesimpulannye, percobaan ini nunjukin kalo pengenalan kembali MFN2 yang tertunda ke PN yang kekurangan parah di OXPHOS cukup buat ngebalikin konsumsi mtDNA dan menginduksi aterosklerosis, sehingga mencegah degenerasi akson dan kematian neuron in vivo.
(A) Skema yang nunjukin jadwal percobaan buat nyuntik AAV yang ngekode MFN2 pas jalur metabolisme yang ditunjukkan diaktifin. (B) Gambar konfokal representatif dari irisan serebelum 12 minggu yang ditransduksi pada 8 minggu pada tikus Mfn2cKO dan dicap dengan antibodi anti-Calbindin. Kanan: Penskalaan serat akson. Skala zoom akson adalah 450 dan 75 μm. (C) Kiri: Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje di loop transduksi AAV (AAV+) (analisis varians satu arah; n = 3 tikus). Kanan: analisis fokus mtDNA di PN yang ditransduksi di minggu ke-12 (uji t yang kagak berpasangan; n = 6 sel dari tiga tikus). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mikrograf elektron transmisi representatif dari PN dari bagian serebelum Mfn2cKO yang ditransduksi dengan vektor virus yang ditunjukkan. Topeng merah muda menggambarkan area yang ditempati oleh dendrit, dan kotak bertitik kuning menggambarkan zoom yang disediakan di sebelah kanan; n mewakili inti. Batang skala, 1μm. (E) nunjukin contoh pewarnaan PCx di PN yang ditransduksi pada 12 minggu. Batang skala, 20μm. OE, overexpression; FC, ganti lipat.
Akhirnya, kite nyelidikin pentingnya kelangsungan hidup sel yang diinduksi peroksidase di PN yang udah ngalamin disfungsi OXPHOS. Kita ngehasilin mCherry yang ngekode AAV-shRNA (RNA jepit rambut pendek) yang secara khusus menargetkan mRNA PCx tikus (AAV-shPCx), dan nyuntik virus atau kontrol acak-acakannya (AAV-scr) ke otak kecil tikus Mfn2cKO. Suntikan dilakukan pada minggu keempat usia (Gambar 5A) untuk mencapai knockdown PCx yang efektif selama periode ketika ekspresi PCx meningkat (Gambar 3C) dan lapisan sel PN masih utuh (Gambar 1A). Perlu dicatet kalo ngejatuhin PCx (Gambar S8A) mengarah ke percepatan kematian PN yang signifikan, yang terbatas pada cincin yang terinfeksi (Gambar 5, B dan C). Untuk memahami mekanisme efek metabolisme yang diinduksi oleh up-regulation PCx, kami mempelajari status redoks PN setelah PCx knockdown dan biosensor optik yang dimediasi AAV Grx1-roGFP2 diekspresikan secara bersamaan (Gambar S8, B sampai D) untuk mengevaluasi glutathione Perubahan relatif potensial peptida redox (383). Terus, kite ngelakuin mikroskop pencitraan seumur hidup fluoresensi dua foton (FLIM) di irisan otak akut Mfn2cKO berusia 7 minggu atau teman-teman kontrol untuk mendeteksi perubahan potensial dalam status redoks sitoplasma setelah memverifikasi kondisi FLIM (Gambar S8, E hingga G). Analisis menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam keadaan oksidasi dari satu Mfn2cKO PNs yang kurang ekspresi PCx, yang berbeda dari neuron kontrol atau Mfn2cKO PNs yang hanya mengekspresikan shRNA acak-acakan (Gambar 5, D dan E). Pas ekspresi PCx diatur ke bawah, persentase Mfn2cKO PN yang nunjukin keadaan yang sangat teroksidasi meningkat lebih dari tiga kali (Gambar 5E), yang nunjukin kalo regulasi PCx mempertahankan kapasitas redoks neuron yang degeneratif.
(A) Skema yang nunjukin jadwal percobaan buat nyuntik AAV yang ngekode shPCx pas jalur metabolisme yang ditunjukkan diaktifin. (B) Foto konfokal representatif dari bagian serebelum 8 minggu pada tikus Mfn2cKO yang ditransduksi dan dilabelin dengan antibodi anti-kalsineurin pada 4 minggu. Bar skala, 450μm. (C) Kuantifikasi kepadatan sel Purkinje di loop yang ditransduksi AAV (analisis varians satu arah; n = 3 sampe 4 tikus). Data dinyatakan sebagai rata-rata±SEM; ***P<0.001. (D) Gambar FLIM representatif nunjukin umur rata-rata PN 7 minggu yang mengekspresikan sensor redoks glutation Grx1-roGFP2 di bawah kondisi eksperimental yang ditentukan. LUT (tabel pencarian) rasio: interval waktu kelangsungan hidup (dalam pikodetik). Batang skala, 25μm. (E) Histogram nunjukin distribusi nilai masa hidup Grx1-roGFP2 dari (D) (n=158 sampe 368 sel di dua tikus di bawah setiap kondisi). Bagan pie di atas setiap histogram: nunjukin jumlah sel dengan nilai umur yang jauh lebih panjang (merah, teroksidasi) atau lebih pendek (biru, berkurang), yang melebihi 1 SD dari nilai umur rata-rata di CTRL-AAV-scr. (F) Model yang diusulin nunjukin efek perlindungan dari peningkatan PCx neuronal.
Semuanye, data yang kite kasih di sini nunjukin kalo ekspresi ulang MFN2 bisa nyelametin PN lanjut dengan defisiensi OXPHOS parah, penipisan mtDNA parah, dan morfologi mirip ista yang sangat abnormal, sehingga memberikan kemajuan terus menerus bahkan dalam penyakit lanjut. Neurodegenerasi memberikan bukti yang dapat dibalikkan dari tahap sebelum kematian sel. Tingkat fleksibilitas metabolisme ini lebih ditekankan oleh kemampuan neuron untuk menginduksi aterosklerosis (pembinaan ulang siklus TCA), yang menghambat ekspresi PCx di PN yang kurang OXPHOS dan meningkatkan kematian sel, sehingga berperan sebagai pelindung (Gambar 5F).
Di penelitian ini, kite ngasih bukti kalo respon PN terhadap disfungsi OXPHOS adalah secara bertahap konvergensi ke aterosklerosis siklus TCA melalui jalur aktivasi diferensial yang diaktifin oleh program metabolisme. Kita konfirmasi analisis proteomik dengan banyak metode pelengkap dan ngungkapin kalo pas ditantang oleh disfungsi mitokondria yang parah, neuron punya bentuk elastisitas metabolisme yang sebelumnya kagak diketahui. Yang bikin kite kaget, seluruh proses rewiring kagak selalu menandai keadaan metabolisme terminal yang menyertai neurodegenerasi secara bertahap dan kagak bisa dibalikin, tapi data kite nunjukin kalo itu mungkin merupakan neuron pemeliharaan bahkan di tahap sebelum kematian sel Mekanisme kompensasi fungsional. Temuan ini nunjukin kalo neuron punya tingkat plastisitas metabolisme yang lumayan gede di tubuh. Fakta ini membuktikan bahwa pengenalan kembali MFN2 kemudian dapat membalikkan ekspresi penanda metabolisme kunci dan mencegah degenerasi PN. Sebaliknya, itu menghambat aterosklerosis dan mempercepat saraf. transeksual.
Salah satu temuan yang paling menarik dalam penelitian kami adalah bahwa PN yang kurang OXPHOS dapat memodifikasi metabolisme siklus TCA dengan mengatur enzim yang secara spesifik merangsang arteriosklerosis. Penataan ulang metabolisme adalah fitur umum dari sel kanker, beberapa di antaranya bergantung pada glutamin untuk melengkapi perantara siklus TCA untuk menghasilkan setara pengurang, yang mendorong rantai pernapasan dan mempertahankan produksi prekursor biosintesis lipid dan nukleotida (39, 40). Penelitian baru-baru ini nunjukin kalo di jaringan tepi yang ngalamin disfungsi OXPHOS, koneksi ulang metabolisme glutamin/glutamat juga merupakan fitur yang menonjol (5, 41), di mana arah masuknya glutamin ke siklus TCA tergantung karena parahnya cedera OXPHOS (41). ). Namun, ada kurangnya bukti yang jelas tentang kesamaan plastisitas metabolisme neuronal dalam tubuh dan kemungkinan relevansinya dalam konteks penyakit. Dalam penelitian in vitro baru-baru ini, neuron kortikal primer ditunjukkan untuk memobilisasi kolam glutamat untuk neurotransmisi, sehingga mempromosikan metabolisme oksidatif dan aterosklerosis di bawah kondisi stres metabolisme (42). Perlu dicatet kalo di bawah penghambatan farmakologis enzim siklus TCA suksinat dehidrogenase, karboksilasi piruvat dipercaya untuk mempertahankan sintesis oksaloasetat dalam neuron granul serebelum yang dikultur (34). Namun, relevansi fisiologis dari mekanisme ini terhadap jaringan otak (di mana aterosklerosis dipercaya terutama terbatas pada astrosit) masih memiliki signifikansi fisiologis yang penting (43). Dalam hal ini, data kami menunjukkan bahwa PN yang dirusak oleh OXPHOS di tubuh dapat beralih ke degradasi BCAA dan karboksilasi piruvat, yang merupakan dua sumber utama suplementasi perantara kolam TCA. Meskipun kontribusi katabolisme BCAA terhadap metabolisme energi neuron telah diusulkan, selain peran glutamat dan GABA untuk neurotransmisi (44), masih belum ada bukti untuk mekanisme ini in vivo. Oleh karena itu, gampang buat berspekulasi kalo PN yang kagak berfungsi bisa secara otomatis ngimbangi konsumsi perantara TCA yang didorong oleh proses asimilasi dengan meningkatkan aterosklerosis. Secara khusus, peningkatan PCx mungkin diperlukan untuk mempertahankan peningkatan permintaan asam aspartat, yang disarankan pada sel yang berkembang biak dengan disfungsi mitokondria (45). Namun, analisis metabolomik kami tidak mengungkapkan perubahan signifikan dalam tingkat steady-state asam aspartat di Mfn2cKO PNs (Gambar S6A), yang mungkin mencerminkan penggunaan metabolisme asam aspartat yang berbeda antara sel yang berkembang biak dan neuron pasca-mitosis. Meskipun mekanisme yang tepat dari peningkatan PCx pada neuron disfungsional in vivo masih harus dikarakterisasi, kami menunjukkan bahwa respons prematur ini berperan penting dalam mempertahankan keadaan redoks neuron, yang ditunjukkan dalam percobaan FLIM pada irisan serebelum. Secara khusus, mencegah PN dari mengatur PCx ​​dapat menyebabkan keadaan yang lebih teroksidasi dan mempercepat kematian sel. Aktivasi degradasi BCAA dan karboksilasi piruvat bukan cara untuk mengkarakterisasi jaringan tepi disfungsi mitokondria (7). Oleh karena itu, mereka tampaknya menjadi fitur prioritas dari neuron yang kekurangan OXPHOS, bahkan jika bukan satu-satunya fitur, yang penting untuk neurodegenerasi. .
Penyakit serebelum adalah jenis penyakit neurodegeneratif heterogen yang biasanya bermanifestasi sebagai ataksia dan sering merusak PN (46). Populasi neuron ini sangat rentan terhadap disfungsi mitokondria karena degenerasi selektif mereka pada tikus cukup untuk mereproduksi banyak gejala motorik yang mencirikan ataksia spinocerebellar manusia (16, 47, 48). Menurut laporan, model tikus transgenik dengan gen mutan terkait dengan ataksia spinocerebellar manusia dan memiliki disfungsi mitokondria (49, 50), menekankan pentingnya mempelajari konsekuensi defisiensi OXPHOS pada PNPH. Oleh karena itu, ini sangat cocok untuk mengisolasi dan mempelajari populasi neuron unik ini secara efektif. Namun, mengingat PNs sangat sensitif terhadap tekanan dan menyumbang proporsi rendah dari seluruh populasi sel serebelum, untuk banyak studi berbasis omics, pemisahan selektif dari mereka sebagai sel utuh masih menjadi aspek yang menantang. Meskipun hampir mustahil untuk mencapai kurangnya kontaminasi mutlak dari jenis sel lain (terutama jaringan dewasa), kami menggabungkan langkah disosiasi yang efektif dengan FACS untuk mendapatkan jumlah neuron yang cukup layak untuk analisis proteomik hilir, dan memiliki cakupan protein yang cukup tinggi (sekitar 3000 protein) dibandingkan dengan kumpulan data serebelum yang ada (15). Dengan melestarikan kelangsungan hidup seluruh sel, metode yang kite sediain di sini memungkinkan kite kagak cuma buat ngecek perubahan jalur metabolisme di mitokondria, tapi juga buat ngecek perubahan di rekan-rekan sitoplasma, yang melengkapi penggunaan tag membran mitokondria buat memperkaya jenis sel Metode baru untuk jumlah mitokondria dalam jaringan kompleks (2555). Metode yang kite jelasin kagak cuma terkait dengan studi sel Purkinje, tapi bisa dengan gampang diterapin ke jenis sel apapun buat ngatasin perubahan metabolisme di otak yang sakit, termasuk model disfungsi mitokondria laennye.
Akhirnya, kite udah identifikasi jendela terapeutik selama proses penataan ulang metabolisme ini yang bisa sepenuhnya ngebalikin tanda-tanda kunci stres seluler dan mencegah degenerasi neuron. Oleh karena itu, memahami implikasi fungsional dari rewiring yang dijelaskan di sini dapat memberikan wawasan mendasar tentang kemungkinan perawatan untuk mempertahankan viabilitas neuron selama disfungsi mitokondria. Penelitian kedepan yang bertujuan untuk membedah perubahan metabolisme energi di jenis sel otak lain diperlukan untuk sepenuhnya mengungkapkan penerapan prinsip ini untuk penyakit saraf lain.
Tikus MitoPark udah dijelasin sebelumnya (31). Tikus C57BL/6N dengan loxP yang mengapit gen Mfn2 telah dijelaskan sebelumnya (18) dan disilangkan dengan tikus L7-Cre (23). Keturunan heterozigot ganda yang dihasilkan kemudian disilangkan dengan tikus Mfn2loxP/Mfn2loxP homozigot untuk menghasilkan knockout gen spesifik Purkinje untuk Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Di subset kawin, alel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) diperkenalkan melalui persimpangan tambahan (20). Semua prosedur hewan dilakukan sesuai dengan pedoman Eropa, nasional dan institusional dan disetujui oleh LandesamtfürNatur dari Umwelt dan Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Jerman. Kerjaan hewan juga ngikutin panduan dari Federasi Eropa Asosiasi Ilmu Hewan Laboratorium.
Setelah membius dislokasi serviks wanita hamil, embrio tikus diisolasi (E13). Korteks dibedah di Larutan Garam Seimbang Hanks (HBSS) yang ditambahin dengan 10 mM Hepes dan dilewatin ke Dulbecco's Modified Eagle's Medium yang mengandung papain (20 U/ml) dan sistein (1μg/ml). Inkubasi jaringan di DMEM) dan disosiasikan dengan pencernaan enzimatik. Ml) di 37°C selama 20 menit, dan kemudian digiling secara mekanis dalam DMEM yang ditambahkan dengan 10% serum sapi janin. Sel-sel dibijikan di penutup kaca yang dilapisi dengan polilisin pada kepadatan 2×106 per piring kultur 6 cm atau pada kepadatan 0,5×105 sel/cm2 untuk analisis pencitraan. Setelah 4 jam, media diganti dengan media bebas serum Neurobasal yang mengandung suplemen B27 1% dan GlutaMax 0,5 mM. Neuron kemudian dipertahankan pada 37°C dan 5% CO2 sepanjang percobaan, dan diberi makan seminggu sekali. Untuk menginduksi rekombinasi in vitro, 3μl (piring kultur 24-sumur) atau 0.5μl (piring 24-sumur) dari vektor virus AAV9 berikut digunakan untuk mengobati neuron pada hari kedua in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, nomor katalog 105530-AAV9) dan AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, nomor katalog 105545-AAV9).
DNA pelengkap Mfn1 dan Mfn2 tikus (diperoleh dari plasmid Addgene #23212 dan #23213, masing-masing) ditandai dengan urutan V5 (GKPIPNPLLGLDST) di C-terminus, dan menyatu dengan mCherry dalam bingkai melalui urutan T2A. Grx1-roGFP2 adalah hadiah dari Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Dengan mengganti kaset tdTomato menggunakan metode kloning konvensional, kaset itu disubkloning ke tulang punggung pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nomor referensi Addgene 28306) untuk menghasilkan pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G Vektor FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 dan pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Strategi yang sama dipake buat ngehasilin vektor kontrol pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Untuk menghasilkan konstruksi AAV-shPCx, vektor AAV plasmid (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) diperlukan, yang mengandung urutan DNA yang mengkodekan shRNA yang menargetkan tikus PCx (5′CTTTCGCTAGCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAGACTTAGA 3′) Di bawah kendali promotor U6, mCherry dipake di bawah kendali promotor CMV. Produksi vektor AAV tambahan dilakukan sesuai dengan instruksi pabrikan (Cell Biolabs). Singkatnya, pake plasmid transfer yang membawa mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) secara sementara Transfeksi sel 293A-MFN2-V5-MFN2-V5 mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) atau Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) gen pengkode, serta pengkode protein kapsid AAV1 dan plasmid kemasan protein aksesori, menggunakan metode kalsium fosfat. Supernatan virus mentah diperoleh dengan siklus beku-cair dalam mandi es kering / etanol dan sel yang dilisis dalam saline penyangga fosfat (PBS). Vektor AAV dimurnikan dengan ultrasentrifugasi gradien iodixanol diskontinu (24 jam pada 32.000 rpm dan 4°C) dan dikonsentrasikan menggunakan filter sentrifugal Amicon ultra-15. Titer genom AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 salinan genom (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX seperti yang dijelaskan sebelumnya (dijelaskan sebelumnya (5), diukur oleh PCR kuantitatif -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) dan AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Neuron primer dikerok di PBS 1x dingin es, dipelet, dan kemudian dihomogenisasi dalam 0,5% Triton X-100 / 0,5% natrium deoksikolat / penyangga lisis PBS yang mengandung fosfatase dan penghambat protease (Roche). Ukuran protein dilakukan dengan menggunakan assay asam bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Protein-protein itu kemudian dipisahin dengan elektroforesis gel SDS-poliakrilamida, dan kemudian diblot ke membran polyvinylidene fluoride (GE Healthcare). Blokir situs non-spesifik dan inkubasi dengan antibodi primer (liat Tabel S1 untuk detail) dalam susu 5% di TBST (Tris-buffered saline dengan Tween), langkah-langkah pencucian dan antibodi sekunder di TBST Inkubasi. Inkubasi dengan antibodi primer semalaman di +4°C. Setelah dicuci, olesin antibodi sekunder selama 2 jam di suhu ruangan. Setelah itu, dengan menginkubasi blot yang sama dengan antibodi anti-β-actin, pemuatan yang sama dikonfirmasi. Deteksi dengan mengubah ke chemiluminescence dan meningkatkan chemiluminescence (GE Healthcare).
Neuron yang sebelumnya ditanam di penutup kaca diperbaiki dengan 4% paraformaldehida (PFA) / PBS pada titik waktu yang ditentukan pada suhu kamar selama 10 menit. Penutup pertama-tama diresap dengan 0.1% Triton X-100/PBS selama 5 menit pada suhu kamar, dan kemudian di penyangga pemblokiran [3% albumin serum sapi (BSA)/PBS]. Di hari kedua, penutup dicuci dengan penyangga penghalang dan diinkubasi dengan antibodi sekunder konjugasi fluorofor yang sesuai selama 2 jam pada suhu kamar; akhirnya, sampel dicuci secara menyeluruh di PBS dengan 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) yang diwarnai dan kemudian diperbaiki di slide mikroskop dengan Aqua-Poly/Mount.
Tikus (jantan dan betina) dibius dengan suntikan intraperitoneal ketamin (130 mg/kg) dan xylazine (10 mg/kg) dan diberikan secara subkutan dengan analgesik carprofen (5 mg/kg), dan diletakkan di instrumen stereotaktik (Kopf) yang dilengkapi dengan bungkus hangat. Pake tengkorak dan pake bor gigi buat nipisin bagian korteks serebelum yang sesuai dengan tulang mis (dari lambda: ekor 1.8, lateral 1, sesuai dengan lobus IV dan V). Pake jarum suntik melengkung buat bikin lubang kecil di tengkorak biar kagak ganggu pembuluh darah di bawah. Terus kapiler kaca tipis yang ditarik perlahan dimasukin ke lubang mikro (dari -1,3 sampe -1 di sisi ventral dura mater), dan 200 sampe 300 nl AAV disuntik ke injektor mikro (Narishige) dengan jarum suntik manual (Narishige) beberapa kali dengan tekanan rendah selama periode waktu 20 menit sampe 10 menit. Setelah infus, taro kapiler selama 10 menit lagi biar virus nyebar sepenuhnya. Setelah kapiler ditarik, kulit dijahit dengan hati-hati untuk meminimalkan peradangan luka dan memungkinkan hewan untuk sembuh. Hewan-hewan itu diobati dengan obat analgesik (caspofen) selama beberapa hari setelah operasi, selama itu kondisi fisik mereka dipantau dengan cermat dan kemudian mereka dieutanasi pada titik waktu yang ditentukan. Semua prosedur dilakukan sesuai dengan pedoman Eropa, nasional dan institusional dan disetujui oleh LandesamtfürNatur dari Umwelt dan Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Jerman.
Hewan-hewan itu dibius dengan ketamin (100 mg/kg) dan xylazine (10 mg/kg), dan jantung diperfusi dengan 0,1 M PBS dulu, dan kemudian dengan 4% PFA dalam PBS. Jaringan dibedah dan diperbaiki dalam 4% PFA/PBS semalaman pada suhu 4°C. Pisau bergetar (Leica Microsystems GmbH, Wina, Austria) dipake buat nyiapin bagian sagital (tebal 50 μm) dari otak yang tetap di PBS. Kecuali kalo ditentuin laen, pewarnaan bagian yang ngambang bebas dilakuin seperti yang dijelasin di atas (13) pada suhu kamar dan diaduk. Singkatnya, pertama, irisan yang didapet dipermeabilisasi dengan 0,5% Triton X-100/PBS selama 15 menit pada suhu kamar; buat beberapa epitope (Pcx dan Shmt2), dengan di tris-EDTA buffer di 80°C (PH 9) panasin irisan selama 25 menit bukan langkah ini. Berikutnya, bagian-bagian diinkubasi dengan antibodi primer (lihat Tabel S1) dalam penyangga pemblokiran (3% BSA/PBS) pada suhu 4°C semalaman dengan diaduk. Besoknya, bagian-bagian dicuci dengan penyangga penghalang dan diinkubasi dengan antibodi sekunder konjugasi fluorofor yang sesuai selama 2 jam pada suhu kamar; akhirnya, bagian-bagian itu dicuci abis-abisan di PBS, diwarnai balik dengan DAPI, dan kemudian diperbaiki dengan AquaPolymount Di slide mikroskop.
Mikroskop konfokal pemindaian laser (TCS SP8-X atau TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) yang dilengkapi dengan laser cahaya putih dan laser ultraviolet dioda 405 digunakan untuk mencitrakan sampel. Dengan menggembirakan fluorofor dan mengumpulkan sinyal dengan Hybrid Detector (HyDs), perangkat lunak LAS-X digunakan untuk mengumpulkan gambar yang ditumpuk sesuai dengan sampling Nyquist dalam mode berurutan: untuk panel non-kuantitatif, itu adalah sinyal yang sangat dinamis (misalnya, dalam sel somatik dan dendrit) mtYFP untuk mendeteksi jumlah Hybrid BPNR mode). Gating dari 0.3 sampe 6 ns diterapin buat ngurangin latar belakang.
Pencitraan waktu nyata dari sel yang diurutin. Setelah disortir di media Neurobasal-A yang mengandung suplemen B27 1% dan 0,5 mM GlutaMax, sel langsung ditanam di slide kaca berlapis poli-l-lisin (μ-Slide8 Nah, Ibidi, nomor katalog 80826), Dan kemudian simpan di 37°C dan CO selama 1 jam untuk memungkinkan sel deprok. Pencitraan waktu nyata dilakukan pada mikroskop konfokal pemindaian laser Leica SP8 yang dilengkapi dengan laser putih, HyD, lensa objektif minyak 63×[1.4 bukaan numerik (NA)] dan tahap pemanasan.
Tikus dengan cepat dibius dengan karbon dioksida dan dipenggal kepalanya, otak dengan cepat dikeluarkan dari tengkorak, dan dipotong menjadi bagian sagittal tebal 200μm (untuk percobaan pelabelan 13C) atau tebal 275μm (untuk dua percobaan foton) yang diisi dengan bahan-bahan berikut Es krim (HM-605, VHerfis, Scientific Walldorf, Jerman) diisi dengan zat-zat berikut: 125 mM es dingin, jenuh karbon (95% O2 dan 5% CO2) Ca2 rendah + cairan serebrospinal buatan (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, m2, mM, glusa 0.5 mM CaCl2 dan 3.5 mM MgCl2 (tekanan osmotik 310 sampe 330 mmol). Pindahin irisan otak yang didapet ke ruang pra-inkubasi yang mengandung Ca2 + ACSF yang lebih tinggi (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 10,0 mM Ca. MgCl2) Medium) pH 7.4 dan 310 sampe 320 mmol).
Selama proses pencitraan, irisan dipindahkan ke ruang pencitraan khusus, dan percobaan dilakukan di bawah perfusi ACSF terus menerus pada suhu konstan 32° hingga 33°C. Mikroskop pemindaian laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) yang dilengkapi dengan lensa objektif Leica 25x (NA 0,95, air), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) digunakan untuk pencitraan irisan. Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM dari Grx1-roGFP2. Perubahan dalam keadaan redoks sitoplasma PN diukur oleh FLIM dua foton di irisan otak sagital, di mana biosensor Grx1-roGFP2 menargetkan PN. Di lapisan PN, bidang akuisisi dipilih sekitar 50 sampe 80 μm di bawah permukaan irisan untuk memastikan bahwa ada PN yang layak (yaitu, kurangnya struktur manik-manik atau perubahan morfologis neuronal di sepanjang dendrit) dan sensor roGFP2 positif ganda dan AAV yang mengkodekan shRNA PCx atau urutan ngontrol urutannya (masing-masing mengontrol mCherry). Ngumpulin gambar tumpukan tunggal dengan zoom digital 2x [panjang gelombang eksitasi: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Deteksi: HyD internal, kelompok filter fluorescein isothiocyanate (FITC)] dan rata-rata gambar dalam 2 sampai 3 menit digunakan untuk memastikan bahwa cukup foton yang dikumpulkan (1000 foton total) untuk pas kurva. Sensitivitas probe Grx1-roGFP2 dan verifikasi kondisi FLIM dilakukan dengan memantau nilai umur roGFP2 ketika menambahkan H2O2 eksogen 10 mM ke ACSF perfusi (untuk memaksimalkan oksidasi, menghasilkan peningkatan umur), dan kemudian menambahkan 2 mM dithiothreit (mengurangi, menghasilkan tingkat pengurangan penurunan umur) (Gambar S8, D sampai G). Pake perangkat lunak FLIMfit 5.1.1 buat nganalisis hasil yang didapet, cocokin kurva peluruhan eksponensial tunggal dari seluruh gambar ke IRF yang diukur (fungsi respon instrumen), dan χ2 kira-kira 1. Buat ngitung umur satu PN, masker di sekitar badan saraf digambar secara manual, dan kuantifikasi umur di tiap topeng digunain.
Analisis potensial mitokondria. Setelah bagian akut diinkubasi dengan 100 nM TMRM yang langsung ditambahkan ke ACSF yang diperfusi selama 30 menit, perubahan potensial mitokondria PN diukur dengan mikroskop dua foton. Pencitraan TMRM dilakukan dengan menggembirakan probe pada 920 nm dan menggunakan HyD internal (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) untuk mengumpulkan sinyal; dengan make panjang gelombang eksitasi yang sama tapi make HyD internal yang beda (FITC :525/50) buat ngegambarin mtYFP. Pake plug-in Kalkulator Gambar ImageJ buat ngevaluasi potensi mitokondria di tingkat sel tunggal. Singkatnya, persamaan plug-in: sinyal = min (mtYFP, TMRM) digunain buat identifikasi daerah mitokondria yang nunjukin sinyal TMRM di Purkinje Somali di gambar konfokal tumpukan tunggal dari saluran yang sesuai. Terus area piksel di masker yang dihasilin diukur, dan kemudian dinormalisasi pada gambar tumpukan tunggal ambang batas yang sesuai dari saluran mtYFP untuk mendapatkan fraksi mitokondria yang menunjukkan potensi mitokondria.
Gambarnya didekonvolusi dengan perangkat lunak Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Untuk gambar ubin yang dipindai, montase ubin tunggal dibuat menggunakan algoritma jahitan otomatis yang disediakan oleh perangkat lunak LAS-X. Setelah kalibrasi gambar, pake ImageJ dan Adobe Photoshop buat ngolah gambar lebih lanjut dan nyesuain kecerahan dan kontras secara seragam. Pake Adobe Illustrator buat persiapan grafis.
analisis fokus mtDNA. Jumlah lesi mtDNA diukur pada bagian serebelum yang dilabelkan dengan antibodi terhadap DNA dengan mikroskop konfokal. Setiap area target dibuat untuk badan sel dan inti setiap sel, dan area masing-masing dihitung menggunakan plug-in Multi Measure (perangkat lunak ImageJ). Kurangin luas inti dari luas badan sel untuk dapetin luas sitoplasma. Akhirnya, plug-in Analyze Particles (perangkat lunak ImageJ) digunain buat ngukur secara otomatis titik DNA sitoplasma yang nunjukin mtDNA di gambar ambang batas, dan hasil yang didapet dinormalisasi ke rata-rata PN tikus CTRL. Hasilnye dinyatakan sebagai jumlah rata-rata nukleosida per sel.
Analisis ekspresi protein. Pake plug-in Kalkulator Gambar ImageJ buat ngevaluasi ekspresi protein di PN di tingkat sel tunggal. Singkatnya, di gambar konfokal lapisan tunggal dari saluran yang sesuai, melalui persamaan: sinyal = min (mtYFP, antibodi), daerah mitokondria yang menunjukkan imunoreaktivitas terhadap antibodi tertentu di Purkina diidentifikasi. Terus area piksel di masker yang dihasilin diukur, dan kemudian dinormalisasi pada gambar tumpukan tunggal ambang batas yang sesuai dari saluran mtYFP untuk mendapatkan fraksi mitokondria dari protein yang ditampilkan.
Analisis kepadatan sel Purkinje. Plug-in penghitung sel dari ImageJ digunakan untuk mengevaluasi kepadatan Purkinje dengan membagi jumlah sel Purkinje yang dihitung dengan panjang cincin serebelum yang ditempati oleh sel yang dihitung.
Persiapan dan pengumpulan sampel. Otak dari kelompok kontrol dan tikus Mfn2cKO diperbaiki dalam 2% PFA / 2,5% glutaraldehida dalam penyangga fosfat 0,1 M (PB), dan kemudian bagian koronal disiapkan menggunakan siliat (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) (Ketebalan 50 sampai 60) Penyangga perbaikan dalam 1% PB tetraoksida dan 1.5% kalium ferrosianida pada suhu ruangan selama 1 jam. Bagian-bagian itu dicuci tiga kali dengan air suling, dan kemudian diwarnai dengan 70% etanol yang mengandung 1% uranil asetat selama 20 menit. Bagian-bagian itu kemudian didehidrasi dalam alkohol bertingkat dan disematkan dalam Durcupan ACM (Araldite casting resin M) resin epoxy (Electron Microscopy Sciences, nomor katalog 14040) di antara slide kaca berlapis silikon, dan akhirnya pada 60°C dipolimerisasi dalam oven selama 48 jam. Area korteks serebelum dipilih dan bagian ultratipis 50 nm dipotong pada Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wina, Austria) dan dipilih pada kisi celah tembaga 2×1 mm yang dilapisi dengan film polistirena. Bagian-bagian diwarnai dengan larutan 4% uranil asetat dalam H2O selama 10 menit, dicuci dengan H2O beberapa kali, kemudian dengan Reynolds lead sitrat dalam H2O selama 10 menit, dan kemudian dicuci dengan H2O beberapa kali. Mikrograf diambil dengan mikroskop elektron transmisi Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) make kamera digital TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Jerman).
Buat tikus yang terinfeksi AAV, otak dipisahin dan diiris jadi bagian sagital setebal 1 mm, dan serebelum diperiksa make mikroskop fluoresensi buat identifikasi cincin yang terinfeksi AAV (yaitu, mengekspresikan mCherry). Cuma percobaan di mana injeksi AAV menghasilkan efisiensi transduksi yang sangat tinggi dari lapisan sel Purkinje (yaitu hampir seluruh lapisan) di setidaknya dua cincin serebelum berturut-turut yang digunakan. Loop yang ditransduksi AAV dimikrodiseksi untuk pasca-fiksasi semalaman (4% PFA dan 2,5% glutaraldehida dalam penyangga kakao 0,1 M) dan diproses lebih lanjut. Untuk penyematan EPON, jaringan tetap dicuci dengan penyangga kakao natrium 0,1 M (Applichem), dan diinkubasi dengan 2% OsO4 (os, Layanan Sains; Caco) dalam penyangga kakao natrium 0,1 M (Applichem) 4 Jam, lalu dicuci selama 2 jam. Ulang 3 kali dengan 0.1 M penyangga kokamida. Setelah itu, seri naik etanol digunakan untuk menginkubasi setiap larutan etanol pada suhu 4°C selama 15 menit untuk mendehidrasi jaringan. Jaringan dipindahkan ke propylene oxide dan diinkubasi semalaman di EPON (Sigma-Aldrich) pada suhu 4°C. Taruh tisu di EPON baru di suhu kamar selama 2 jam, lalu sematkan di 62°C selama 72 jam. Pake ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) dan pisau berlian (Diatome, Biel, Swiss) buat motong bagian ultratipis 70 nm, dan nodain dengan 1,5% uranil asetat selama 15 menit di 37°C, dan nodain dengan larutan sitrat timah 4 menit. Mikrograf elektron diambil make mikroskop elektron transmisi JEM-2100 Plus (JEOL) yang dilengkapi dengan Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) dan perangkat lunak DigitalMicrograph (Gatan). Buat analisis, mikrograf elektron didapet dengan zoom digital 5000× atau 10,000×.
Analisis morfologis mitokondria. Untuk semua analisis, kontur mitokondria individu digarisbawahi secara manual dalam gambar digital menggunakan perangkat lunak ImageJ. Parameter morfologis yang berbeda dianalisis. Kepadatan mitokondria dinyatakan sebagai persentase yang diperoleh dengan membagi total luas mitokondria dari setiap sel dengan luas sitoplasma (luas sitoplasma = luas sel-luas inti sel) × 100. Kebulatan mitokondria dihitung dengan rumus [4π∙(luas/perimeter 2)]. Morfologi ista mitokondria dianalisis dan dibagi menjadi dua kategori ("tubular" dan "blister") sesuai dengan bentuk utama mereka.
Analisis jumlah dan kepadatan autofagosom/lisosom. Pake perangkat lunak ImageJ buat ngegambarin kontur dari tiap autofagosom/lisosom di gambar digital. Luas autofagosom/lisosom dinyatakan sebagai persentase yang dihitung dengan membagi total luas struktur autofagosom/lisosom dari setiap sel dengan luas sitoplasma (luas sitoplasma=luas sel-luas inti)×100. Kepadatan autofagosom/lisosom dihitung dengan membagi jumlah total dengan jumlah struktur autofagosom/lisosom per sel (dalam hal luas sitoplasma) (luas sitoplasma = luas sel-luas inti).
Pelabelan untuk pemotongan akut dan persiapan sampel. Untuk percobaan yang membutuhkan pelabelan glukosa, transfer irisan otak akut ke ruang pra-inkubasi, yang mengandung karbon jenuh (95% O2 dan 5% CO2), Ca2 + ACSF tinggi (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 2,5 mM NaCl, 2,5 mM. d-glukosa, 1,0 mM CaCl 2 dan 2,0 mM MgCl 2, disesuaikan dengan pH 7,4 dan 310 hingga 320 mOsm), di mana glukosa adalah 13 C 6- Substitusi glukosa (Eurisotop, nomor katalog CLM-1396). Untuk percobaan yang membutuhkan pelabelan piruvat, transfer irisan otak akut ke Ca2 + ACSF yang lebih tinggi (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM penyangga natrium fosfat, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukosa, 10 mM Ca, dan 20 mM Ca. MgCl2, sesuaikan ke pH 7.4 dan 310 ke 320mOsm), dan tambahkan 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, nomor katalog CLM-1082). Inkubasi bagian-bagian selama 90 menit di 37°C. Di akhir percobaan, bagian-bagian dicuci dengan cepat dengan larutan berair (pH 7.4) yang mengandung 75 mM amonium karbonat, dan kemudian dihomogenisasi dalam 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: air. Setelah bagian-bagian diinkubasi di atas es selama 30 menit, sampel disentrifugasi pada 21.000 g selama 10 menit pada suhu 4°C, dan supernatan bening dikeringkan dalam konsentrator SpeedVac. Pelet metabolit kering yang dihasilkan disimpan pada -80°C sampai dianalisis.
Analisis kromatografi cair-spektrometri massa dari 13 asam amino berlabel C. Untuk analisis kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS), pelet metabolit disuspensi ulang dalam 75μl air kelas LC-MS (Honeywell). Setelah sentrifugasi pada 21.000 g selama 5 menit pada suhu 4°C, 20 μl dari supernatan yang diklarifikasi digunakan untuk analisis fluks asam amino, sementara sisa ekstrak langsung digunakan untuk analisis anion (lihat di bawah). Analisis asam amino dilakukan menggunakan protokol derivatisasi benzoil klorida yang dijelaskan sebelumnya (55, 56). Di langkah pertama, 10μl 100 mM natrium karbonat (Sigma-Aldrich) ditambahkan ke 20μl ekstrak metabolit, dan kemudian 10μl 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) ditambahkan ke ACN kelas LC. Sampel diputar sebentar dan kemudian disentrifugasi pada 21,000 g selama 5 menit pada suhu 20°C. Pindahin supernatan yang udah dibersihin ke vial autosampler 2 ml dengan sisipan kaca kerucut (volume 200 μl). Sampel dianalisis make sistem LC kinerja tinggi Acquity iClass (Waters) yang terhubung ke spektrometer massa presisi resolusi tinggi Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Buat analisis, 2μl dari sampel turunan disuntikkan ke kolom T3 silika kekuatan tinggi 100×1.0 mm (Waters) yang mengandung partikel 1.8μm. Laju aliran 100μl/min, dan sistem penyangga terdiri dari penyangga A (10 mM amonium format dan 0,15% asam formik dalam air) dan penyangga B (ACN). Gradiennye adalah sebagai berikut: 0%B di 0 menit; 0%B. 0 sampe 15% B di 0 sampe 0.1 menit; 15 sampe 17% B di 0.1 sampe 0.5 menit; B di 17 sampe 55% di 0.5 sampe 14 menit; B di 55 sampe 70% di 14 sampe 14.5 menit; di 14.5 sampe 70 sampe 100% B di 18 menit; 100% B di 18 sampe 19 menit; 100 sampe 0% B di 19 sampe 19.1 menit; 0% B di 19.1 sampe 28 menit (55, 56). Spektrometer massa QE-HF beroperasi dalam mode ionisasi positif dengan rentang massa m/z (rasio massa/muatan) dari 50 hingga 750. Resolusi yang diterapkan adalah 60.000, dan target ion kontrol gain (AGC) yang diperoleh adalah 3×106, dan waktu ion maksimum adalah 100 mili detik. Sumber ionisasi elektrospray yang dipanaskan (ESI) beroperasi pada tegangan semprotan 3,5 kV, suhu kapiler 250°C, aliran udara sarung 60 AU (unit sewenang-wenang), dan aliran udara tambahan 20 AU. 250°C. Lensa S diset ke 60 AU.
Analisis kromatografi anion-MS dari asam organik berlabel 13C. Sisa endapan metabolit (55μl) dianalisis make sistem kromatografi ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) yang dihubungin ke spektrometer massa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Singkatnya, 5μl ekstrak metabolit disuntikkan ke kolom Dionex IonPac AS11-HC yang dilengkapi dengan HPLC (2 mm×250 mm, ukuran partikel 4μm, Thermo Fisher Scientific) dalam mode loop parsial push-in dengan rasio pengisian 1.) Dionex IonPac AG11-HC mmguard, kolom HC mm x 250 4μm, Thermo Fisher Scientific). Suhu kolom dijaga di 30°C, dan autosampler diatur ke 6°C. Pake kartrid kalium hidroksida yang dilengkapi dengan air deionisasi untuk menghasilkan gradien kalium hidroksida melalui generator eluen. Pemisahan metabolit dengan laju aliran 380μl/menit, dengan menerapkan gradien berikut: 0 hingga 3 menit, 10 mM KOH; 3 sampe 12 menit, 10 sampe 50 mM KOH; 12 sampe 19 menit, 50 sampe 100 mM KOH; 19 sampe 21 menit, 100 mM KOH; 21 sampe 21.5 menit, 100 sampe 10 mM KOH. Kolom diseimbangkan kembali di bawah 10 mM KOH selama 8,5 menit.
Metabolit yang dielusi dikombinasikan dengan aliran suplemen isopropanol 150μl/min setelah kolom dan kemudian diarahkan ke spektrometer massa resolusi tinggi yang beroperasi dalam mode ionisasi negatif. MS lagi ngawasin rentang massa dari m/z 50 sampe 750 dengan resolusi 60,000. AGC diatur ke 1×106, dan waktu ion maksimum dijaga di 100 ms. Sumber ESI yang dipanasin dioperasiin dengan tegangan semprotan 3.5 kV. Pengaturan lain dari sumber ion adalah sebagai berikut: suhu kapiler 275°C; aliran gas sarung, 60 AU; aliran gas tambahan, 20 AU pada 300°C, dan pengaturan lensa S ke 60 AU.
Analisis data metabolit berlabel 13C. Pake perangkat lunak TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific) buat analisis data rasio isotop. Identitas dari setiap senyawa diverifikasi oleh senyawa referensi yang andal dan dianalisis secara independen. Untuk melakukan analisis pengayaan isotop, luas kromatogram ion yang diekstraksi (XIC) dari setiap isotop 13C (Mn) diekstraksi dari [M + H] +, di mana n adalah nomor karbon dari senyawa target, digunakan untuk menganalisis asam amino atau [MH] + digunakan untuk menganalisis anion. Akurasi massa XIC kurang dari lima bagian per juta, dan akurasi RT 0,05 menit. Analisis pengayaan dilakukan dengan menghitung rasio dari setiap isotop yang terdeteksi terhadap jumlah semua isotop dari senyawa yang sesuai. Rasio-rasio ini diberikan sebagai nilai persentase untuk setiap isotop, dan hasilnya dinyatakan sebagai pengayaan persentase molar (MPE), seperti yang dijelaskan sebelumnya (42).
Pelet neuron beku dihomogenisasi dalam metanol 80% dingin es (v/v), diputar, dan diinkubasi pada -20°C selama 30 menit. Putar lagi sampel dan aduk di +4°C selama 30 menit. Sampel disentrifugasi pada 21.000 g selama 5 menit pada suhu 4°C, dan kemudian supernatan yang dihasilkan dikumpulkan dan dikeringkan menggunakan konsentrator SpeedVac pada suhu 25°C untuk analisis selanjutnya. Seperti yang dijelasin di atas, analisis LC-MS dilakukan pada asam amino dari sel yang diurutin. Pake TraceFinder (versi 4.2, Thermo Fisher Scientific), analisis data dilakuin make massa monoisotopik dari tiap senyawa. Normalisasi kuantil data metabolit dilakukan menggunakan paket perangkat lunak preprocessCore (57).
Persiapan irisan. Tikus dengan cepat dibius dengan karbon dioksida dan dipenggal, otak dengan cepat dikeluarkan dari tengkorak, dan pisau bergetar yang diisi es (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jerman) digunakan untuk memotongnya menjadi bagian sagital 300 hingga 375 μm gasifikasi karbon dioksida (25%) Ca2 + ACSF rendah (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM penyangga natrium fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 1.0 mM CaCl2 dan 6.0 mM MgCl2 Sesuaikan dengan pH 47 dan 30 mM). Pindahin irisan otak yang didapet ke ruangan yang mengandung Ca2 + ACSF yang lebih tinggi (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM penyangga natrium fosfat, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukosa, 4.0 ml mM CaCl dan pH 3 MC 7.4 dan 310 sampe 320 mOsm). Simpan irisan selama 20 sampe 30 menit biar bisa dipulihin sebelum direkam.
rekaman. Panggung mikroskop yang dilengkapi dengan ruang rekaman tetap dan lensa objektif perendaman air 20x (Scientifica) digunakan untuk semua rekaman. Sel Purkinje yang diduga diidentifikasi oleh (i) ukuran tubuh, (ii) lokasi anatomi otak kecil, dan (iii) ekspresi gen reporter mtYFP fluoresen. Pipet tambalan dengan ketahanan ujung 5 sampe 11 megohm ditarik keluar oleh kapiler kaca borosilikat (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Jerman) dan pipet horizontal Instruments (P-10000), Notova, CA). Semua rekaman dilakukan oleh ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Jerman), yang dikontrol oleh perangkat lunak Signal (versi 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Percobaan direkam dengan laju sampling 12.5 kHz. Sinyal disaring dengan dua filter Bessel short-pass dengan frekuensi cutoff masing-masing 1,3 dan 10 kHz. Kapasitas membran dan pipet dikompensasi oleh sirkuit kompensasi menggunakan penguat. Semua percobaan dilakukan di bawah kontrol kamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jerman), yang dikontrol oleh perangkat lunak Hokawo (versi 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jerman).
Konfigurasi dan analisis sel utuh rutin. Segera sebelum ngerekam, isi pipet dengan larutan internal yang mengandung zat-zat berikut: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kalium glukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (MM), 5 mM Gunofosit. (GTP) (Na) dan 10.0 mM kreatinin fosfat disesuaikan dengan pH 7.25, dan tekanan osmotik adalah 290 mOsm (sukrosa). Segera setelah menerapkan gaya 0 pA untuk mecahin membran, potensial membran istirahat diukur. Ketahanan masukan diukur dengan menerapkan arus hiperpolarisasi -40, -30, -20, dan -10 pA. Ukur besarnya respon tegangan dan pake hukum Ohm buat ngitung resistensi masukan. Aktivitas spontan direkam di penjepit tegangan selama 5 menit, dan sPSC diidentifikasi dan diukur di Igor Pro (versi 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) menggunakan skrip pengenalan semi-otomatis. Kurva IV dan arus steady-state diukur dengan menjepit baterai pada potensial yang berbeda (mulai dari -110 mV) dan meningkatkan tegangan dalam langkah 5 mV. Produksi AP diuji dengan menerapkan arus depolarisasi. Jepit sel di -70 mV sambil nerapin pulsa arus depolarisasi. Sesuaikan ukuran langkah dari setiap unit rekaman secara terpisah (10 sampai 60 pA). Hitung frekuensi AP maksimum dengan ngitung secara manual lonjakan denyut nadi yang menyebabkan frekuensi AP tertinggi. Ambang batas AP dianalisis dengan menggunakan turunan kedua dari pulsa depolarisasi yang pertama kali memicu satu atau lebih AP.
Konfigurasi dan analisis tambalan berlubang. Lakuin rekaman tambalan berlubang pake protokol standar. Pake pipet bebas ATP dan GTP yang kagak mengandung bahan-bahan berikut: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA dan 2 mM MgCl2, dan sesuaikan ke pH 7,2 (pake KOH). ATP dan GTP dihilangkan dari larutan intraseluler untuk mencegah permeabilitas membran sel yang kagak terkendali. Pipet tambalan diisi dengan larutan internal yang mengandung amphotericin (sekitar 200 sampai 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) untuk mendapatkan catatan tambalan yang ditebuk. Amfoterisin dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (konsentrasi akhir: 0,1 sampai 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsentrasi DMSO yang dipake kagak punya efek yang signifikan pada neuron yang dipelajari. Selama proses pukulan, ketahanan saluran (Ra) terus dipantau, dan percobaan dimulai setelah amplitudo Ra dan AP stabil (20-40 menit). Aktivitas spontan diukur di penjepit tegangan dan/atau arus selama 2 sampe 5 menit. Analisis data dilakukan menggunakan Igor Pro (versi 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versi 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) dan GraphPad Prism (versi 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Amerika Serikat). Buat identifikasi AP spontan, plug-in NeuroMatic v3.0c IgorPro dipake. Identifikasi AP secara otomatis make ambang batas yang diberikan, yang disesuaikan secara individual untuk setiap catatan. Pake interval spike, tentuin frekuensi spike dengan frekuensi spike instan maksimum dan frekuensi spike rata-rata.
Isolasi PN. Dengan beradaptasi dengan protokol yang dipublikasikan sebelumnya, PNs dimurnikan dari serebelum tikus pada tahap tertentu (58). Singkatnya, serebelum dibedah dan dicincang di media disosiasi dingin es [tanpa HBSS Ca2+ dan Mg2+, ditambahin dengan 20 mM glukosa, penisilin (50 U/ml) dan streptomisin (0,05 mg/ml)], dan kemudian dicerna media di papain papa [HBSS, ditambahin stein (1 mg / ml), papain (16 U / ml) dan deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Perlakuin selama 30 menit di 30°C. Pertama cuci jaringan di media HBSS yang mengandung lendir telur (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) dan DNase (0.1 mg/ml) pada suhu kamar untuk mencegah pencernaan enzimatik, dan kemudian di media HBSS yang mengandung glukosa 20 mM Giling lembut di HBSS peillinic (10 mg/ml) (0.05 mg/ml) dan DNase (0.1 mg/ml) ngelepasin sel tunggal. Suspensi sel yang dihasilkan disaring melalui saringan sel 70μm, kemudian sel-sel dipelet dengan sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) dan disuspensikan kembali dalam media penyortiran [HBSS, ditambah dengan glukosa 20 mM, 20% janin sapi) Serum, pelinik (50) dan strepilin (0.05 mg/ml)]; evaluasi viabilitas sel dengan propidium iodida dan sesuaikan kepadatan sel ke 1×106 hingga 2×106 sel/ml. Sebelum sitometri aliran, suspensi disaring melalui saringan sel 50 μm.
Flow cytometer. Penyortiran sel dilakukan pada suhu 4°C menggunakan mesin FACSAria III (BD Biosciences) dan perangkat lunak FACSDiva (BD Biosciences, versi 8.0.1). Suspensi sel diurutin pake nosel 100 μm di bawah tekanan 20 psi dengan kecepatan ~2800 kejadian/detik. Karena kriteria gating tradisional (ukuran sel, diskriminasi bimodal, dan karakteristik hamburan) kagak bisa mastiin isolasi PN yang bener dari jenis sel laen, strategi gating diatur berdasarkan perbandingan langsung intensitas YFP dan autofluoresensi di mitoYFP+ ​​dan kontrol mitoYFP − Tikus. YFP tereksitasi dengan menyinari sampel dengan garis laser 488 nm, dan sinyal dideteksi menggunakan filter band pass 530/30 nm. Di tikus mitoYFP+, kekuatan relatif gen reporter Rosa26-mitoYFP juga digunain buat ngebedain badan neuron dan fragmen akson. 7-AAD tereksitasi dengan laser kuning 561 nm dan dideteksi dengan filter bandpass 675/20 nm untuk mengecualikan sel mati. Untuk memisahkan astrosit pada saat yang sama, suspensi sel diwarnai dengan ACSA-2-APC, lalu sampel diradiasi dengan garis laser 640 nm, dan filter bandpass 660/20 nm digunakan untuk mendeteksi sinyal.
Sel yang dikumpulkan dipelet dengan sentrifugasi (1110 rpm, 5 menit, 4°C) dan disimpan pada -80°C sampai digunakan. Tikus Mfn2cKO dan anak-anak mereka diklasifikasikan pada hari yang sama untuk meminimalkan variabilitas prosedur. Penyajian dan analisis data FACS dilakukan menggunakan perangkat lunak FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Seperti yang udah disebutin di atas (59), PCR real-time dipake buat ngisolasi DNA dari neuron yang diurutin buat kuantifikasi mtDNA selanjutnya. Linearitas dan sensitivitas ambang batas awalnya diuji dengan menjalankan qPCR pada jumlah sel yang berbeda. Singkatnya, kumpulin 300 PN di penyangga lisis yang terdiri dari 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 dan proteinase K (200 ng/ml) dan inkubasi pada suhu 55°C 120 menit. Sel-sel diinkubasi lebih lanjut pada suhu 95°C selama 10 menit untuk memastikan inaktivasi lengkap proteinase K. Menggunakan probe TaqMan (Thermo Fisher) spesifik untuk mt-Nd1, mtDNA diukur dengan PCR semi-kuantitatif dalam sistem PCR Real-Time 7900HT (Thermo Fisher Scientifics). Sains, nomor katalog Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog AIVI3E8) dan 18S (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog Hs99999901_s1) gen.
Persiapan sampel proteom. Dengan manasin larutan di 95°C selama 10 menit dan sonikasi, di penyangga lisis [6 M guanidin klorida, 10 mM tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorida, 10 mM kloroasetamida dan 100 mM tris-Lise beku di pelet neuron HC]. Pake Bioruptor (Diagenode) selama 10 menit (30 detik pulsa / 30 detik periode jeda). Sampel diencerkan 1:10 dalam 20 mM tris-HCl (pH 8.0), dicampur dengan 300 ng trypsin gold (Promega), dan diinkubasi semalaman pada suhu 37°C untuk mencapai pencernaan lengkap. Di hari kedua, sampel disentrifugasi pada 20,000 g selama 20 menit. Supernatan diencerin dengan asam formik 0.1%, dan larutan dihilangin garam dengan StageTips buatan sendiri. Sampel dikeringkan dalam instrumen SpeedVac (konsentrator Eppendorf plus 5305) pada suhu 45°C, dan kemudian peptida disuspensikan dalam asam formik 0,1%. Semua sampel disiapin secara bersamaan oleh orang yang sama. Untuk nganalisis sampel astrosit, 4 μg peptida yang kagak garam dicap dengan tag massa tandem (TMT10plex, nomor katalog 90110, Thermo Fisher Scientific) dengan rasio reagen peptida ke TMT 1:20. Untuk pelabelan TMT, 0,8 mg reagen TMT disuspensikan kembali dalam 70 μl ACN anhidrat, dan peptida kering direkonstitusi menjadi 9 μl 0,1 M TEAB (triethylammonium bikarbonat), di mana 7 μl reagen TMT dalam ACN ditambahkan. Konsentrasinya 43.75%. Setelah 60 menit inkubasi, reaksi dipadamkan dengan 2 μl 5% hidroksilamin. Peptida yang dilabelin dikumpulin, dijemur, disuspensi ulang di 200μl asam formik (FA) 0,1%, dibagi jadi dua, dan kemudian dihilangin garam pake StageTips buatan sendiri. Pake UltiMate 3000 kromatografi cair ultra tinggi (UltiMate 3000 kromatografi cair ultra tinggi), salah satu dari dua bagian difraksikan pada kolom kromatografi Acquity 1mm x 150mm yang diisi dengan partikel C18 130Å1.7μm (Waters, katalog No SKU: 1965). Thermo Fisher Scientific). Pisahin peptida dengan laju aliran 30μl/menit, pisahin dari 1% sampe 50% penyangga B selama 85 menit dengan gradien bertahap 96 menit, dari 50% sampe 95% penyangga B selama 3 menit, trus 8 menit buat 95% Buffer B; Penyangga A adalah 5% ACN dan 10 mM amonium bikarbonat (ABC), dan penyangga B adalah 80% ACN dan 10 mM ABC. Kumpulin pecahan setiap 3 menit dan gabungin jadi dua kelompok (1 + 17, 2 + 18, dll.) dan keringin di sentrifugal vakum.
Analisis LC-MS/MS. Untuk spektrometri massa, peptida (nomor r119.aq) dipisahin di kolom analitik PicoFrit 25 cm, 75 μm diameter dalem (lensa objektif baru, nomor bagian PF7508250) yang dilengkapi dengan 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Maischr, Maisch, UAS-YAS). 1200 (Thermo Fisher Scientific, Jerman). Kolom dipertahankan pada suhu 50°C. Penyangga A dan B adalah 0.1% asam formik dalam air dan 0.1% asam formik dalam 80% ACN, masing-masing. Peptida dipisahin dari 6% sampe 31% penyangga B selama 65 menit dan dari 31% sampe 50% penyangga B selama 5 menit dengan gradien 200 nl/menit. Peptida yang dieluasi dianalisis pada spektrometer massa Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Pengukuran m/z prekursor peptida dilakukan dengan resolusi 120.000 di kisaran 350 hingga 1500 m/z. Pake energi tabrakan normal 27%, prekursor terkuat dengan keadaan muatan 2 sampe 6 dipilih buat pembelahan perangkap C energi tinggi (HCD). Waktu siklus diatur ke 1 detik. Nilai m/z dari fragmen peptida diukur di perangkap ion make target AGC terkecil 5×104 dan waktu injeksi maksimum 86 ms. Setelah fragmentasi, prekursor ditaro di daftar pengecualian dinamis selama 45 detik. Peptida berlabel TMT dipisahin di kolom Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, nomor katalog 164942), dan spektrum migrasi dianalisis di spektrometer massa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) yang dilengkapi dengan bentuk gelombang simetris medan tinggi (IMS) peralatan (Thermo Fisher Scientific) beroperasi pada dua tegangan kompensasi -50 dan -70 V. MS3 yang dipilih berdasarkan prekursor sinkronisasi digunakan untuk pengukuran sinyal ion laporan TMT. Pemisahan peptida dilakukan pada EASY-nLC 1200, menggunakan elusi gradien linier 90%, dengan konsentrasi penyangga 6% hingga 31%; penyangga A adalah 0.1% FA, dan penyangga B adalah 0.1% FA dan 80% ACN. Kolom analitik dioperasikan pada suhu 50°C. Pake FreeStyle (versi 1.6, Thermo Fisher Scientific) buat ngebagi file asli sesuai tegangan kompensasi FAIMS.
Identifikasi dan kuantifikasi protein. Pake mesin pencari Andromeda terpadu, data asli dianalisis pake MaxQuant versi 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Selain urutan Cre rekombinase dan YFP yang didapet dari Aequorea victoria, spektrum fragmen peptida dicari untuk urutan kanonik dan urutan isoform dari proteom referensi tikus (Proteome ID UP000000589, diunduh dari UniProt pada Mei 2017) . Oksidasi metionin dan asetilasi N-terminal protein diatur sebagai modifikasi variabel; metilasi karbamoil sistein diatur sebagai modifikasi tetap. Parameter pencernaan diatur ke "spesifisitas" dan "trypsin/P". Jumlah minimum peptida dan peptida silet yang dipake buat identifikasi protein adalah 1; jumlah minimum peptida unik adalah 0. Di bawah kondisi pencocokan peta peptida, tingkat identifikasi protein adalah 0,01. Opsi "Peptida Kedua" diaktifin. Pake opsi "match between runs" buat mindahin identifikasi yang berhasil antara file asli yang berbeda. Pake rasio minimum LFQ hitungan 1 buat kuantifikasi bebas label (LFQ) (60). Intensitas LFQ disaring untuk setidaknya dua nilai valid di setidaknya satu kelompok genotipe pada setiap titik waktu, dan diekstrapolasi dari distribusi normal dengan lebar. 0.3 dan turun 1.8. Pake platform komputasi Perseus (https://maxquant.net/perseus/) dan R (https://r-project.org/) buat nganalisis hasil LFQ. Uji t moderat dua arah dari paket perangkat lunak limma digunakan untuk analisis ekspresi diferensial (61). Analisis data eksplorasi dilakukan menggunakan ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally dan pheatmap. Data proteomik berbasis TMT dianalisis pake MaxQuant versi 1.6.10.43. Cari data proteomik mentah dari database proteomik manusia UniProt, yang diunduh pada September 2018. Analisis termasuk faktor koreksi kemurnian isotop yang disediakan oleh pabrikan. Pake limma di R buat analisis ekspresi diferensial. Data asli, hasil pencarian database, dan alur kerja dan hasil analisis data semua disimpan di aliansi ProteomeXchange melalui repositori mitra PRIDE dengan pengidentifikasi set data PXD019690.
Anotasi fungsional memperkaya analisis. Alat Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) dipake buat nentuin kekayaan istilah anotasi fungsional dari set data pada 8 minggu (Gambar 1). Singkatnya, daftar protein kuantitatif yang didapet dari analisis data LC-MS/MS (spektrometri massa tandem) digunain dengan kriteria filter berikut: Mus musculus dipilih sebagai spesies dan latar belakang, dan kategori menunjukkan nilai P yang disesuaikan oleh Benjamini untuk pengayaan 0,05 atau lebih rendah dianggap signifikan. Untuk grafik ini, lima kategori kelebihan teratas di setiap kluster berdasarkan nilai P yang disesuaikan ditunjukkan. Pake uji t ganda, make program dorongan linier dua tahap dari Benjamini, Krieger, dan Yekutieli (Q = 5%), analisis ekspresi protein kursus waktu dilakukan pada kandidat penting yang diidentifikasi di setiap kategori, dan setiap baris dianalisis secara terpisah. Gak perlu ngadopsi SD yang konsisten.
Untuk membandingkan hasil penelitian ini dengan database yang dipublikasikan dan menghasilkan diagram Venn di Gambar 1, kami menggabungkan daftar protein kuantitatif dengan anotasi MitoCarta 2.0 (24). Pake alat online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) buat bikin diagram.
Untuk informasi rinci tentang prosedur statistik yang digunakan untuk analisis proteomik, silakan lihat bagian Bahan dan Metode yang sesuai. Untuk semua percobaan lain, informasi rinci dapat ditemukan di legenda yang sesuai. Kecuali kalo dinyatain laen, semua data dinyatain sebagai rata-rata ± SEM, dan semua analisis statistik dilakuin make perangkat lunak GraphPad Prism 8.1.2.
Buat bahan tambahan buat artikel ini, tolong liat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, yang memungkinkan penggunaan, distribusi dan reproduksi di media apapun, selama penggunaan akhir bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah bahwa karya aslinya benar. Petunjuk.
Catatan: Kita cuma minta lu buat ngasih alamat email lu biar orang yang lu rekomendasiin ke halaman tau kalo lu pengen mereka ngeliat emailnya dan kalo itu bukan spam. Kita kagak bakalan ngambil alamat email.
Pertanyaan ini dipake buat ngetes apakah lu pengunjung dan mencegah pengiriman spam otomatis.
Oleh E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik dari neuron yang kagak berfungsi nunjukin kalo program metabolisme diaktifin buat ngelawan neurodegenerasi.
Oleh E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Analisis proteomik dari neuron yang kagak berfungsi nunjukin kalo program metabolisme diaktifin buat ngelawan neurodegenerasi.
©2020 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. semua hak dilindungi. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.