Teori pertahanan tanaman yang berbeda memberikan panduan teoritis penting untuk menjelaskan pola metabolisme khusus tanaman, tetapi prediksi kunci mereka masih harus diuji. Di sini, kite make analisis spektrometri massa tandem (MS/MS) yang kagak bias buat secara sistematis ngejelajahin metabolom strain yang dilemahin tembakau dari tanaman individu ke populasi dan spesies yang terkait erat, dan ngolah sejumlah besar teori fitur spektrometri massa berdasarkan spektrum senyawa dalam informasi. Kerangka kerja buat ngetes prediksi kunci dari teori pertahanan optimal (OD) dan target bergerak (MT). Komponen informasi metabolomik tanaman konsisten dengan teori OD, tapi bertentangan dengan prediksi utama teori MT tentang dinamika metabolomik yang disebabkan oleh herbivora. Dari skala evolusi mikro ke makro, sinyal jasmonat diidentifikasi sebagai penentu utama OD, sementara sinyal etilen memberikan penyetelan halus dari respon spesifik herbivora yang dianotasi oleh jaringan molekuler MS / MS.
Metabolit khusus dengan struktur yang beragam adalah peserta utama dalam adaptasi tanaman terhadap lingkungan, terutama dalam pertahanan musuh (1). Diversifikasi luar biasa dari metabolisme khusus yang ditemuin di tanaman telah merangsang puluhan tahun penelitian mendalam tentang banyak aspek fungsi ekologisnya, dan telah membentuk daftar panjang teori pertahanan tanaman, yaitu perkembangan evolusi dan ekologis interaksi tanaman-serangga. Penelitian empiris memberikan panduan penting (2). Namun, teori-teori pertahanan tanaman ini kagak ngikutin jalur normatif penalaran deduktif hipotetis, di mana prediksi kunci berada pada tingkat analisis yang sama (3) dan diuji secara eksperimental untuk memajukan siklus pengembangan teoritis berikutnya (4). Keterbatasan teknis membatasi pengumpulan data ke kategori metabolisme tertentu dan mengecualikan analisis komprehensif metabolit khusus, sehingga mencegah perbandingan antar kategori yang penting untuk pengembangan teoritis (5). Kurangnya data metabolomik yang komprehensif dan mata uang umum untuk membandingkan alur kerja pemrosesan ruang metabolisme antara kelompok tanaman yang berbeda menghambat kematangan ilmiah bidang.
Perkembangan terbaru di bidang metabolomik spektrometri massa tandem (MS/MS) dapat secara komprehensif mencirikan perubahan metabolisme dalam dan antar spesies dari clade sistem tertentu, dan dapat dikombinasikan dengan metode komputasi untuk menghitung kesamaan struktural antara campuran kompleks ini. Pengetahuan sebelumnya tentang kimia (5). Kombinasi teknologi canggih dalam analisis dan komputasi memberikan kerangka kerja yang diperlukan untuk pengujian jangka panjang dari banyak prediksi yang dibuat oleh teori ekologis dan evolusioner keragaman metabolisme. Shannon (6) ngenalin teori informasi untuk pertama kalinya di artikel seminalnya di 1948, meletakkan dasar untuk analisis matematika informasi, yang telah digunakan di banyak bidang selain aplikasi aslinya. Di genomik, teori informasi udah berhasil diterapin buat ngukur informasi konservatif urutan (7). Dalam penelitian transkriptomik, teori informasi menganalisis perubahan keseluruhan dalam transkriptom (8). Di penelitian sebelumnya, kite nerapin kerangka statistik teori informasi ke metabolomik buat ngegambarin keahlian metabolisme tingkat jaringan di tanaman (9). Di sini, kite gabungin alur kerja berbasis MS/MS dengan kerangka statistik teori informasi, yang dicirikan oleh keragaman metabolisme dalam mata uang umum, untuk membandingkan prediksi kunci teori pertahanan tanaman dari metabolom yang diinduksi oleh herbivora.
Kerangka teoritis pertahanan tanaman biasanya saling inklusif dan dapat dibagi menjadi dua kategori: yang mencoba menjelaskan distribusi metabolit spesifik tanaman berdasarkan fungsi pertahanan, seperti pertahanan optimal (OD) (10), target bergerak (MT) (11) ) Dan teori penampilan (12), sementara yang lain mencari penjelasan mekanis bagaimana perubahan ketersediaan sumber daya mempengaruhi pertumbuhan tanaman dan akumulasi metabolit khusus, seperti karbon: hipotesis keseimbangan nutrisi (13), hipotesis laju pertumbuhan (14), dan hipotesis keseimbangan pertumbuhan dan diferensiasi (15). Dua kumpulan teori berada pada tingkat analisis yang berbeda (4). Namun, dua teori yang melibatkan fungsi pertahanan pada tingkat fungsional mendominasi pembicaraan tentang pertahanan konstitutif dan induksi tanaman: teori OD, yang berasumsi bahwa tanaman berinvestasi dalam pertahanan kimia mahal mereka hanya ketika dibutuhkan, misalnya, ketika mereka ditelan Ketika hewan rumput menyerang, oleh karena itu, sesuai dengan kemungkinan, senyawa dengan fungsi pertahanan di masa depan dirancang sebagai pertahanan (10); hipotesis MT mengusulkan bahwa kagak ada sumbu perubahan metabolit arah, tapi metabolit berubah secara acak, sehingga menciptakan kemungkinan Menghalangi "target gerak" metabolisme menyerang herbivora. Dengan kata lain, dua teori ini membuat prediksi yang berlawanan tentang remodeling metabolisme yang terjadi setelah serangan herbivora: hubungan antara akumulasi searah metabolit dengan fungsi pertahanan (OD) dan perubahan metabolisme non-terarah (MT) (11).
Hipotesis OD dan MT kagak cuma melibatkan perubahan yang diinduksi di metabolom, tapi juga konsekuensi ekologis dan evolusioner dari akumulasi metabolit ini, seperti biaya adaptif dan manfaat dari perubahan metabolisme ini di lingkungan ekologis tertentu (16). Meskipun kedua hipotesis mengakui fungsi pertahanan metabolit khusus, yang mungkin atau mungkin tidak mahal, prediksi kunci yang membedakan hipotesis OD dan MT terletak pada arah perubahan metabolisme yang diinduksi. Prediksi teori OD udah dapet perhatian eksperimental paling banyak sejauh ini. Tes-tes ini termasuk studi fungsi pertahanan langsung atau kagak langsung dari jaringan yang berbeda dari senyawa spesifik di rumah kaca dan kondisi alami, serta perubahan dalam tahap perkembangan tanaman (17-19). Namun, sejauh ini, karena kurangnya alur kerja dan kerangka statistik untuk analisis komprehensif global keragaman metabolisme dari organisme apa pun, prediksi perbedaan utama antara kedua teori (yaitu, arah perubahan metabolisme) masih harus diuji. Di sini, kite ngasih analisis kayak gitu.
Salah satu karakteristik paling signifikan dari metabolit spesifik tanaman adalah keragaman struktural mereka yang ekstrim di semua tingkatan dari tanaman tunggal, populasi hingga spesies yang mirip (20). Banyak perubahan kuantitatif dalam metabolit khusus dapat diamati pada skala populasi, sementara perbedaan kualitatif yang kuat biasanya dipertahankan pada tingkat spesies (20). Oleh karena itu, keragaman metabolisme tanaman adalah aspek utama dari keragaman fungsional, yang mencerminkan kemampuan beradaptasi terhadap relung yang berbeda, terutama relung dengan kemungkinan invasi yang berbeda oleh serangga khusus dan herbivora umum (21). Sejak artikel inovatif Fraenkel (22) tentang alasan keberadaan metabolit spesifik tanaman, interaksi dengan berbagai serangga telah dianggap sebagai tekanan seleksi penting, dan interaksi ini dipercaya telah membentuk tanaman selama evolusi. Jalur metabolisme (23). Perbedaan antar spesies dalam keragaman metabolit khusus mungkin juga mencerminkan keseimbangan fisiologis yang terkait dengan pertahanan tanaman konstitutif dan induksi terhadap strategi herbivora, karena kedua spesies sering berkorelasi negatif satu sama lain (24). Meskipun mungkin menguntungkan untuk mempertahankan pertahanan yang baik setiap saat, perubahan metabolisme tepat waktu yang terkait dengan pertahanan memberikan manfaat yang jelas dalam memungkinkan tanaman untuk mengalokasikan sumber daya berharga untuk investasi fisiologis lainnya (19, 24), dan menghindari kebutuhan untuk simbiosis. Kerusakan kolateral (25). Selain itu, reorganisasi metabolit khusus yang disebabkan oleh herbivora serangga ini dapat menyebabkan distribusi destruktif dalam populasi (26), dan dapat mencerminkan pembacaan langsung perubahan alami substansial dalam sinyal asam jasmonik (JA), yang dapat dipertahankan dalam populasi. Sinyal JA tinggi dan rendah adalah pertukaran antara pertahanan terhadap herbivora dan persaingan dengan spesies tertentu (27). Selain itu, jalur biosintesis metabolit khusus akan mengalami kehilangan dan transformasi yang cepat selama evolusi, yang menghasilkan distribusi metabolisme yang berantakan di antara spesies yang terkait erat (28). Polimorfisme ini dapat dengan cepat didirikan sebagai respon terhadap perubahan pola herbivora (29), yang berarti bahwa fluktuasi komunitas herbivora adalah faktor kunci yang mendorong heterogenitas metabolisme.
Di sini, kita secara khusus nyelesain masalah-masalah berikut. (I) Gimana caranya serangga herbivora ngekonfigurasi ulang metabolom tanaman? (Ii) Apa komponen informasi utama dari plastisitas metabolisme yang dapat diukur untuk menguji prediksi teori pertahanan jangka panjang? (Iii) Apakah harus memprogram ulang metabolom tanaman dengan cara yang unik bagi penyerang, jika iya, apa peran hormon tanaman dalam menyesuaikan respon metabolisme tertentu, dan metabolit mana yang berkontribusi pada spesifisitas pertahanan spesies? (Iv) Karena prediksi yang dibuat oleh banyak teori pertahanan dapat diperluas ke semua tingkat jaringan biologis, kami bertanya seberapa konsisten respon metabolisme yang disebabkan dari perbandingan internal ke perbandingan antar spesies? Untuk tujuan ini, kami telah secara sistematis mempelajari metabolom daun nikotin tembakau, yang merupakan tanaman model ekologis dengan metabolisme khusus yang kaya, dan efektif terhadap larva dua herbivora asli, Lepidoptera Datura (Ms) (Sangat agresif, terutama dimakan) Pada Solanaceae dan Spodoptera (Storalist), adalah jenis cacing daun "genus", dengan tanaman inang Solanaceae dan inang lain dari genera dan keluarga lain Makanan tanaman. Kita ngeparse spektrum metabolomik MS/MS dan ngambil deskriptor statistik teori informasi buat ngebandingin teori OD dan MT. Bikin peta spesifisitas buat ngungkapin identitas metabolit kunci. Analisis diperluas ke populasi asli N. nasi dan spesies tembakau yang terkait erat untuk lebih lanjut menganalisis kovarian antara pensinyalan hormon tanaman dan induksi OD.
Untuk menangkap peta keseluruhan tentang plastisitas dan struktur metabolom daun tembakau herbivora, kami menggunakan analisis dan alur kerja perhitungan yang dikembangkan sebelumnya untuk secara komprehensif mengumpulkan dan mendekonvolusi spektrum MS / MS independen data resolusi tinggi dari ekstrak tanaman ( 9). Metode yang kagak dibedain ini (disebut MS/MS) dapat membangun spektrum senyawa non-redundansi, yang kemudian dapat digunakan untuk semua analisis tingkat senyawa yang dijelaskan di sini. Metabolit tanaman yang terdekonvolusi ini ada berbagai jenis, terdiri dari ratusan hingga ribuan metabolit (sekitar 500-1000-s/MS/MS di sini). Di sini, kite mempertimbangkan plastisitas metabolisme dalam kerangka teori informasi, dan mengukur keragaman dan profesionalisme metabolom berdasarkan entropi Shannon dari distribusi frekuensi metabolisme. Pake rumus yang udah diimplementasiin sebelumnya (8), kite ngitung seperangkat indikator yang bisa dipake buat ngukur keragaman metabolom (indikator Hj), spesialisasi profil metabolisme (indikator δj) dan spesifisitas metabolisme dari satu metabolit (indikator Si). Selain itu, kite nerapin Indeks Plastisitas Jarak Relatif (RDPI) buat ngukur induksibilitas metabolom herbivora (Gambar 1A) (30). Dalam kerangka statistik ini, kite memperlakukan spektrum MS/MS sebagai unit informasi dasar, dan memproses kelimpahan relatif MS/MS ke dalam peta distribusi frekuensi, dan kemudian menggunakan entropi Shannon untuk memperkirakan keragaman metabolom dari itu. Spesialisasi metabolom diukur dengan spesifisitas rata-rata dari satu spektrum MS/MS. Oleh karena itu, peningkatan kelimpahan beberapa kelas MS/MS setelah induksi herbivora diubah menjadi induksi spektral, RDPI dan spesialisasi, yaitu peningkatan indeks δj, karena lebih banyak metabolit khusus yang diproduksi dan indeks Si yang tinggi diproduksi. Penurunan indeks keragaman Hj mencerminkan bahwa jumlah MS/MS yang dihasilkan berkurang, atau distribusi frekuensi profil berubah ke arah yang kurang seragam, sambil mengurangi ketidakpastian secara keseluruhan. Lewat perhitungan indeks Si, dimungkinkan untuk menyoroti MS/MS mana yang diinduksi oleh herbivora tertentu, sebaliknya, MS/MS mana yang tidak merespon induksi, yang merupakan indikator kunci untuk membedakan prediksi MT dan OD.
(A) Deskriptor statistik yang dipake buat herbivora (H1 sampe Hx) MS/MS data-inducibility (RDPI), keragaman (indeks Hj), spesialisasi (indeks δj) dan spesifisitas metabolit (indeks Si). Peningkatan tingkat spesialisasi (δj) nunjukin kalo, rata-rata, lebih banyak metabolit spesifik herbivora yang bakal diproduksi, sementara penurunan keragaman (Hj) nunjukin penurunan produksi metabolit atau distribusi metabolit yang kagak merata di peta distribusi. Nilai Si menilai apakah metabolit itu spesifik untuk kondisi tertentu (di sini, herbivora) atau sebaliknya dipertahankan pada tingkat yang sama. (B) Diagram konseptual prediksi teori pertahanan menggunakan sumbu teori informasi. Teori OD memprediksi bahwa serangan herbivora akan meningkatkan metabolit pertahanan, sehingga meningkatkan δj. Pada saat yang sama, Hj menurun karena profil diatur ulang ke arah ketidakpastian informasi metabolisme yang berkurang. Teori MT memprediksi bahwa serangan herbivora akan menyebabkan perubahan non-arah dalam metabolom, sehingga meningkatkan Hj sebagai indikator peningkatan ketidakpastian informasi metabolisme dan menyebabkan distribusi acak Si. Kita juga ngusulin model campuran, MT terbaik, di mana beberapa metabolit dengan nilai pertahanan yang lebih tinggi akan meningkat secara khusus (nilai Si tinggi), sementara yang lain menunjukkan respon acak (nilai Si yang lebih rendah).
Pake deskriptor teori informasi, kite menafsirkan teori OD buat memprediksi bahwa perubahan metabolit khusus yang diinduksi herbivora dalam keadaan konstitutif yang kagak diinduksi bakal mengarah ke (i) peningkatan spesifisitas metabolisme (indeks Si) yang mendorong spesifisitas metabolisme (indeks δj) Peningkatan) kelompok metabolit khusus tertentu dengan nilai pertahanan yang lebih tinggi, dan (ii) penurunan keragaman indeks metabolisme (Hj) karena perubahan distribusi frekuensi metabolisme ke distribusi tubuh leptin yang lebih banyak. Di tingkat metabolit tunggal, distribusi Si yang teratur diharapkan, di mana metabolit akan meningkatkan nilai Si sesuai dengan nilai pertahanannya (Gambar 1B). Sepanjang garis ini, kite jelasin teori MT buat memprediksi kalo eksitasi bakalan mengarah ke (i) perubahan non-arah dalam metabolit yang ngakibatin penurunan indeks δj, dan (ii) peningkatan indeks Hj karena peningkatan ketidakpastian metabolisme. Atau keacakan, yang bisa diukur dengan entropi Shannon dalam bentuk keragaman umum. Kalo soal komposisi metabolisme, teori MT bakalan memprediksi distribusi acak Si. Memperhitungkan bahwa metabolit tertentu berada dalam kondisi tertentu dalam kondisi tertentu, dan kondisi lain tidak dalam kondisi tertentu, dan nilai pertahanan mereka tergantung pada lingkungan, kami juga mengusulkan model pertahanan campuran, di mana δj dan Hj terdistribusi dalam dua di sepanjang Peningkatan Si ke semua arah, hanya kelompok metabolit tertentu, yang memiliki nilai pertahanan yang lebih tinggi, terutama akan meningkat, sementara Siure lain akan memiliki distribusi acak (Gambar 1B).
Untuk ngetes prediksi teori pertahanan yang didefinisikan ulang pada sumbu deskriptor teori informasi, kami membesarkan larva herbivora ahli (Ms) atau generalis (Sl) pada daun Nepenthes pallens (Gambar 2A). Pake analisis MS/MS, kite ngambil 599 spektrum MS/MS non-redundansi (file data S1) dari ekstrak metanol dari jaringan daun yang dikumpulin setelah dikasih makan ulat. Pake indeks RDPI, Hj, dan δj buat ngebayangin konfigurasi ulang isi informasi di file konfigurasi MS/MS ngungkapin pola yang menarik (Gambar 2B). Tren keseluruhan adalah bahwa, seperti yang dijelaskan oleh deskriptor informasi, saat ulat terus makan daun, tingkat semua reorganisasi metabolisme meningkat dari waktu ke waktu: 72 jam setelah herbivora makan, RDPI meningkat secara signifikan. Dibandingin ama kontrol yang kagak rusak, Hj berkurang secara signifikan, yang disebabkan oleh peningkatan tingkat spesialisasi profil metabolisme, yang diukur dengan indeks δj. Tren yang keliatan ini konsisten dengan prediksi teori OD, tapi kagak konsisten dengan prediksi utama teori MT, yang percaya bahwa perubahan acak (non-arah) dalam tingkat metabolit digunakan sebagai kamuflase pertahanan (Gambar 1B). Meskipun kandungan elicitor sekresi oral (OS) dan perilaku makan dari dua herbivora ini berbeda, makan langsung mereka menghasilkan perubahan yang sama dalam arah Hj dan δj selama periode panen 24 jam dan 72 jam. Cuma perbedaannye terjadi di 72 jam RDPI. Dibandingin ama yang disebabkan oleh makan Ms, metabolisme keseluruhan yang disebabkan oleh makan Sl lebih tinggi.
(A) Desain eksperimental: babi umum (S1) atau ahli (Ms) herbivora diberi makan dengan daun yang didesalinasikan dari tanaman pitcher, sementara untuk herbivora simulasi, OS dari Ms (W + OSMs) digunakan untuk menangani tusukan luka posisi daun standar. S1 (W + OSSl) larva atau air (W + W). Kontrol (C) adalah daun yang kagak rusak. (B) Induksibilitas (RDPI dibandingkan dengan bagan kontrol), keragaman (indeks Hj) dan indeks spesialisasi (indeks δj) dihitung untuk peta metabolit khusus (599 MS / MS; file data S1). Tanda bintang nunjukin perbedaan yang signifikan antara makan herbivora langsung dan kelompok kontrol (Student's t-test dengan t-test berpasangan, *P<0.05 dan ***P<0.001). ns, kagak penting. (C) Indeks resolusi waktu utama (kotak biru, asam amino, asam organik dan gula; file data S2) dan spektrum metabolit khusus (kotak merah 443 MS/MS; file data S1) setelah perlakuan herbivora simulasi. Pita warna mengacu pada interval kepercayaan 95%. Tanda bintang nunjukin perbedaan signifikan antara perlakuan dan kontrol [analisis varians kuadrat (ANOVA), diikuti oleh perbedaan signifikan jujur ​​Tukey (HSD) untuk perbandingan ganda post hoc, *P<0.05, **P<0.01 Dan *** P <0.001]. (D) Spesialisasi plot hamburan dan profil metabolit khusus (sampel berulang dengan perlakuan yang berbeda).
Buat ngejelajahin apakah remodeling yang diinduksi herbivora di tingkat metabolom tercermin dalam perubahan tingkat metabolit individu, kite pertama-tama fokus ke metabolit yang sebelumnya dipelajari di daun Nepenthes pallens dengan ketahanan herbivora yang terbukti. Amida fenolik adalah konjugat hidroksisinamida-poliamin yang menumpuk selama proses herbivora serangga dan diketahui mengurangi kinerja serangga (32). Kita nyari prekursor dari MS/MS yang sesuai dan ngeplot kurva kinetik kumulatif mereka (Gambar S1). Gak heran, turunan fenol yang kagak terlibat langsung dalam pertahanan terhadap herbivora, seperti asam klorogenat (CGA) dan rutin, diatur ke bawah setelah herbivora. Sebaliknya, herbivora dapat membuat fenol amida sangat kuat. Pemberian makan yang terus menerus dari dua herbivora menghasilkan spektrum eksitasi fenolamida yang hampir sama, dan pola ini sangat jelas untuk sintesis de novo fenolamida. Fenomena yang sama bakal diamati pas ngejelajahin jalur 17-hidroksigeranyl nonanediol diterpene glycosides (17-HGL-DTGs), yang menghasilkan sejumlah besar diterpen asiklik dengan fungsi anti-herbivora yang efektif (33), di mana Ms Feeding dengan Sl memicu ekspresi yang mirip (Gambar S1)).
Kerugian yang mungkin dari percobaan makan herbivora langsung adalah perbedaan tingkat konsumsi daun dan waktu makan herbivora, yang membuat sulit untuk menghilangkan efek spesifik herbivora yang disebabkan oleh luka dan herbivora. Untuk lebih baik memecahkan spesifisitas spesies herbivora dari respon metabolisme daun yang diinduksi, kami mensimulasikan pemberian makan larva Ms dan Sl dengan segera menerapkan OS yang baru dikumpulkan (OSM dan OSS1) ke tusukan standar W dari posisi daun yang konsisten. Prosedur ini disebut perawatan W + OS, dan itu menstandarisasi induksi dengan tepat waktu onset respon yang dipicu oleh herbivora tanpa menyebabkan efek membingungkan dari perbedaan laju atau kuantitas kehilangan jaringan (Gambar 2A) (34). Pake analisis MS/MS dan pipeline kalkulasi, kite ngambil 443 spektrum MS/MS (file data S1), yang tumpang tindih dengan spektrum yang sebelumnya dirakit dari percobaan umpan langsung. Analisis teori informasi dari kumpulan data MS/MS ini nunjukin kalo pemrograman ulang metabolom khusus daun dengan simulasi herbivora nunjukin induksi spesifik OS (Gambar 2C). Secara khusus, dibandingin dengan perawatan OSS1, OSM menyebabkan peningkatan spesialisasi metabolom pada 4 jam. Perlu dicatet kalo dibandingin ama set data eksperimental makan herbivora langsung, kinetika metabolisme yang divisualisasikan di ruang dua dimensi make Hj dan δj sebagai koordinat dan arah spesialisasi metabolom sebagai respons terhadap perlakuan herbivora simulasi dari waktu ke waktu Peningkatan konsisten (Gambar 2D). Pada saat yang sama, kami mengukur kandungan asam amino, asam organik dan gula (file data S2) untuk menyelidiki apakah peningkatan keahlian metabolom yang ditargetkan ini disebabkan oleh rekonfigurasi metabolisme karbon pusat sebagai respons terhadap herbivora yang disimulasikan (Gambar S2). Buat lebih ngejelasin pola ini, kite lebih lanjut memantau kinetika akumulasi metabolisme dari jalur fenolamida dan 17-HGL-DTG yang udah dibahas sebelumnya. Induksi spesifik OS dari herbivora diubah menjadi pola penataan ulang diferensial dalam metabolisme fenolamida (Gambar S3). Amida fenolik yang mengandung kumarin dan bagian caffeoyl lebih disukai diinduksi oleh OSS1, sementara OSM memicu induksi konjugat ferulil spesifik. Untuk jalur 17-HGL-DTG, induksi OS diferensial oleh produk malonilasi dan dimalonilasi hilir terdeteksi (Gambar S3).
Berikutnye, kite mempelajari plastisitas transkriptom yang diinduksi OS make set data microarray time-course, yang mensimulasikan penggunaan OSM untuk merawat daun daun tanaman roset pada herbivora. Kinetika pengambilan sampel pada dasarnya tumpang tindih dengan kinetika yang digunakan dalam studi metabolomik ini (35). Dibandingin ama rekonfigurasi metabolom di mana plastisitas metabolisme meningkat dari waktu ke waktu, kite ngeliat ledakan transkripsi sementara di daun yang diinduksi oleh Ms, di mana induksibilitas transkriptom (RDPI) dan spesialisasi (δj) ada di 1 Ada peningkatan signifikan dalam jam, dan keragaman (Hj) pada titik waktu ini, ekspresi BMP1 berkurang secara signifikan, diikuti oleh relaksasi spesialisasi transkriptom (Gambar S4). Keluarga gen metabolisme (seperti P450, glycosyltransferase, dan BAHD acyltransferase) berpartisipasi dalam proses merakit metabolit khusus dari unit struktural yang berasal dari metabolisme primer, mengikuti model spesialisasi tinggi awal yang disebutkan sebelumnya. Sebagai studi kasus, jalur fenilalanin dianalisis. Analisis mengkonfirmasi bahwa gen inti dalam metabolisme fenolamida sangat diinduksi OS pada herbivora dibandingkan dengan tanaman yang tidak tertarik, dan sejajar erat dalam pola ekspresi mereka. Faktor transkripsi MYB8 dan gen struktural PAL1, PAL2, C4H dan 4CL di hulu jalur ini menunjukkan inisiasi awal transkripsi. Asiltransferase yang berperan dalam perakitan akhir fenolamida, seperti AT1, DH29, dan CV86, menunjukkan pola peningkatan yang berkepanjangan (Gambar S4). Pengamatan di atas nunjukin kalo inisiasi awal spesialisasi transkriptom dan peningkatan spesialisasi metabolomik kemudian adalah mode yang digabungkan, yang mungkin disebabkan oleh sistem pengaturan sinkron yang memulai respon pertahanan yang kuat.
Konfigurasi ulang dalam pensinyalan hormon tanaman bertindak sebagai lapisan pengatur yang mengintegrasikan informasi herbivora untuk memprogram ulang fisiologi tanaman. Setelah simulasi herbivora, kite ngukur dinamika kumulatif dari kategori hormon tanaman kunci dan ngevisualisasiin ko-ekspresi temporal di antara mereka [koefisien korelasi Pearson (PCC)> 0,4] (Gambar 3A). Seperti yang diharapkan, hormon tanaman yang terkait dengan biosintesis terkait dalam jaringan ko-ekspresi hormon tanaman. Selain itu, spesifisitas metabolisme (indeks Si) dipetakan ke jaringan ini untuk menyoroti hormon tanaman yang diinduksi oleh perlakuan yang berbeda. Dua area utama respon spesifik herbivora digambar: satu adalah di kluster JA, di mana JA (bentuk aktif biologisnya JA-Ile) dan turunan JA lainnya menunjukkan skor Si tertinggi; yang laen adalah etilen (ET). Gibberellin cuma nunjukin peningkatan sedang dalam spesifisitas herbivora, sementara hormon tanaman lain, seperti sitokinin, auksin, dan asam absisat, memiliki spesifisitas induksi yang rendah untuk herbivora. Dibandingin dengan make W + W doang, amplifikasi nilai puncak turunan JA lewat aplikasi OS (W + OS) pada dasarnya bisa diubah jadi indikator spesifik JA yang kuat. Gak disangka, OSM dan OSS1 dengan kandungan elicitor yang berbeda diketahui menyebabkan akumulasi JA dan JA-Ile yang mirip. Berbeda dengan OSS1, OSM secara spesifik dan kuat diinduksi oleh OSM, sementara OSS1 kagak memperkuat respon luka basal (Gambar 3B).
(A) Analisis jaringan ko-ekspresi berdasarkan perhitungan PCC simulasi kinetika akumulasi hormon tanaman yang diinduksi herbivora. Simpul mewakili satu hormon tanaman, dan ukuran simpul mewakili indeks Si spesifik untuk hormon tanaman di antara perlakuan. (B) Akumulasi JA, JA-Ile dan ET di daun yang disebabkan oleh perlakuan yang berbeda yang ditunjukkan oleh warna yang berbeda: aprikot, W + OSM; biru, W + OSSl; hitam, W + W; abu-abu, C (kontrol) . Tanda bintang nunjukin perbedaan yang signifikan antara perawatan dan kontrol (ANOVA dua arah diikuti oleh perbandingan ganda post hoc Tukey HSD, *** P <0,001). Analisis teori informasi dari (C)697 MS/MS (file data S1) di biosintesis JA dan spektrum persepsi yang terganggu (irAOC dan irCOI1) dan (D)585 MS/MS (file data S1) di ETR1 dengan sinyal ET yang terganggu Dua perlakuan herbivora simulasi memicu garis tanaman dan kontrol kendaraan kosong (EV) tanaman. Tanda bintang nunjukin perbedaan yang signifikan antara perlakuan W+OS dan kontrol yang kagak rusak (ANOVA dua arah diikuti oleh perbandingan ganda post hoc Tukey HSD, *P<0.05, **P<0.01 dan ***P<0.001). (E) Grafik tersebar dari oposisi tersebar terhadap spesialisasi. Warna-warna itu ngewakilin strain yang dimodifikasi secara genetik yang berbeda; simbol-simbol itu mewakili metode perawatan yang berbeda: segitiga, W + OSS1; persegi panjang, W + OSM; lingkaran C
Berikutnye, kite make strain yang dimodifikasi secara genetik dari Nepenthes yang dilemahin (irCOI1 dan sETR1) di langkah-langkah kunci biosintesis JA dan ET (irAOC dan irACO) dan persepsi (irCOI1 dan sETR1) buat nganalisis metabolisme dua hormon tanaman ini pada herbivora Kontribusi relatif pemrograman ulang. Konsisten dengan percobaan sebelumnya, kite konfirmasi induksi herbivora-OS di tanaman pembawa kosong (EV) (Gambar 3, C sampe D) dan penurunan keseluruhan indeks Hj yang disebabkan oleh OSM, sementara indeks δj meningkat. Responnya lebih ketara daripada respon yang dipicu oleh OSS1. Grafik dua garis make Hj dan δj sebagai koordinat nunjukin deregulasi spesifik (Gambar 3E). Tren yang paling jelas adalah bahwa pada strain yang kurang sinyal JA, keragaman metabolom dan perubahan spesialisasi yang disebabkan oleh herbivora hampir sepenuhnya dihilangkan (Gambar 3C). Sebaliknya, persepsi ET diam di tanaman sETR1, meskipun efek keseluruhan pada perubahan metabolisme herbivora jauh lebih rendah daripada pensinyalan JA, melemahkan perbedaan indeks Hj dan δj antara eksitasi OSM dan OSS1 (Gambar 3D dan Gambar S5). . Ini nunjukin kalo selain fungsi inti transduksi sinyal JA, transduksi sinyal ET juga berfungsi sebagai penyetelan halus respon metabolisme spesifik spesies herbivora. Konsisten dengan fungsi penyetelan halus ini, kagak ada perubahan dalam induksibilitas metabolom secara keseluruhan di tanaman sETR1. Di sisi lain, dibandingin ama tanaman sETR1, tanaman irACO menginduksi amplitudo keseluruhan yang mirip dari perubahan metabolisme yang disebabkan oleh herbivora, tetapi menunjukkan skor Hj dan δj yang berbeda secara signifikan antara tantangan OSM dan OSS1 (Gambar S5).
Untuk identifikasi metabolit khusus yang punya kontribusi penting terhadap respon spesifik spesies herbivora dan menyempurnakan produksi mereka melalui sinyal ET, kami menggunakan metode MS / MS struktural yang dikembangkan sebelumnya. Metode ini bergantung pada metode bi-clustering untuk menyimpulkan kembali keluarga metabolisme dari fragmen MS / MS [produk titik normalisasi (NDP)] dan skor kesamaan berdasarkan kehilangan netral (NL). Set data MS/MS yang dibangun melalui analisis garis transgenik ET menghasilkan 585 MS/MS (file data S1), yang diselesaikan dengan mengkelompokkannya menjadi tujuh modul MS/MS utama (M) (Gambar 4A). Beberapa modul ini dikemas padat dengan metabolit khusus yang udah dicirikan sebelumnya: misalnya, M1, M2, M3, M4 dan M7 kaya akan berbagai turunan fenol (M1), glikosida flavonoid (M2), gula asil (M3 dan M4), dan 17-HGL-DTG (M7). Selain itu, informasi spesifik metabolisme (indeks Si) dari satu metabolit di setiap modul dihitung, dan distribusi Si-nya dapat dilihat secara intuitif. Singkatnya, spektrum MS/MS yang menunjukkan spesifisitas herbivora dan genotipe tinggi ditandai dengan nilai Si yang tinggi, dan statistik kurtosis menunjukkan distribusi bulu di sudut ekor kanan. Salah satu distribusi koloid ramping terdeteksi di M1, di mana fenol amida menunjukkan fraksi Si tertinggi (Gambar 4B). Herbivora inducible 17-HGL-DTG yang disebutin sebelumnya di M7 nunjukin skor Si sedang, yang nunjukin tingkat regulasi diferensial sedang antara dua jenis OS. Sebaliknya, kebanyakan metabolit khusus yang diproduksi secara konstitutif, seperti rutin, CGA, dan gula asil, adalah salah satu skor Si terendah. Untuk lebih mengeksplorasi kompleksitas struktural dan distribusi Si antara metabolit khusus, jaringan molekuler dibangun untuk setiap modul (Gambar 4B). Prediksi penting dari teori OD (dirangkum dalam Gambar 1B) adalah bahwa reorganisasi metabolit khusus setelah herbivora harus mengarah ke perubahan satu arah dalam metabolit dengan nilai pertahanan tinggi, terutama dengan meningkatkan spesifisitas mereka (berbeda dengan distribusi acak) Mode) Metabolit pertahanan yang diprediksi oleh teori MT. Kebanyakan turunan fenol yang terkumpul di M1 secara fungsional terkait dengan penurunan kinerja serangga (32). Pas ngebandingin nilai Si di metabolit M1 antara daun yang diinduksi dan daun konstituen tanaman kontrol EV pada 24 jam, kite ngeliat kalo spesifisitas metabolisme banyak metabolit setelah serangga herbivora punya tren peningkatan yang signifikan (Gambar 4C). Peningkatan spesifik nilai Si cuma terdeteksi di fenolamida defensif, tapi kagak ada peningkatan nilai Si yang terdeteksi di fenol lain dan metabolit yang kagak diketahui yang hidup berdampingan di modul ini. Ini adalah model khusus, yang terkait dengan teori OD. Prediksi utama perubahan metabolisme yang disebabkan oleh herbivora konsisten. Untuk ngetes apakah kekhususan spektrum fenolamida ini diinduksi oleh ET spesifik OS, kite ngeplot indeks metabolit Si dan nyebabin nilai ekspresi diferensial antara OSM dan OSS1 di genotipe EV dan sETR1 (Gambar 4D). Di sETR1, perbedaan yang diinduksi fenamida antara OSM dan OSS1 sangat berkurang. Metode bi-clustering juga diterapin ke data MS/MS yang dikumpulin di strain dengan JA yang kagak cukup buat nyimpulin modul MS/MS utama yang terkait dengan spesialisasi metabolisme yang diatur JA (Gambar S6).
(A) Hasil pengelompokan 585 MS/MS berdasarkan fragmen bersama (kemiripan NDP) dan kehilangan netral bersama (kemiripan NL) menghasilkan modul (M) yang konsisten dengan keluarga senyawa yang diketahui, atau oleh komposisi Metabolit yang tidak diketahui atau kurang metabolisme. Di sebelah tiap modul, distribusi metabolit (MS/MS) spesifik (Si) ditunjukin. (B) Jaringan molekuler modular: Node mewakili MS/MS dan tepi, NDP (merah) dan NL (biru) skor MS/MS (cut-off,> 0.6). Indeks spesifisitas metabolit bertingkat (Si) diwarnai berdasarkan modul (kiri) dan dipetakan ke jaringan molekuler (kanan). (C) Modul M1 dari tanaman EV dalam keadaan konstitutif (kontrol) dan diinduksi (herbivora simulasi) pada 24 jam: diagram jaringan molekuler (nilai Si adalah ukuran node, fenolamida defensif disorot dengan warna biru). (D) Diagram jaringan molekuler M1 dari garis spektrum sETR1 dengan persepsi EV dan ET yang rusak: senyawa fenolik yang diwakili oleh node lingkaran hijau, dan perbedaan signifikan (nilai P) antara perlakuan W + OSM dan W + OSS1 sebagai ukuran Node. CP, N-caffeoyl-tyrosine; CS, N-caffeoyl-spermidine; FP, asam N-ferulat ester-asam urat; FS, N-ferulyl-spermidine; CoP, N', N “-Coumarolyl-tyrosine; DCS, N’, N”-dicaffeoyl-spermidine; CFS, N', N”-caffeoyl, feruloyl-spermidine; Lycium barbarum in wolfberry Son; Nick. O-AS, O-asil gula.
Kita lebih lanjut memperluas analisis dari satu genotipe Nepenthes yang dilemahkan ke populasi alami, di mana perubahan intraspesifik yang kuat dalam tingkat JA herbivora dan tingkat metabolit spesifik sebelumnya telah dijelaskan pada populasi alami (26). Pake kumpulan data ini buat nutupin 43 germplasma. Germplasma ini terdiri dari 123 spesies tanaman dari N. pallens. Tanaman ini diambil dari benih yang dikumpulkan di berbagai habitat asli di Utah, Nevada, Arizona, dan California (Gambar S7), kami menghitung keragaman metabolom (di sini disebut tingkat populasi) keragaman β) dan spesialisasi yang disebabkan oleh OSM. Konsisten dengan penelitian sebelumnya, kite ngeliat berbagai perubahan metabolisme di sepanjang sumbu Hj dan δj, yang nunjukin kalo germplasma punya perbedaan yang signifikan dalam plastisitas respon metabolisme mereka terhadap herbivora (Gambar S7). Organisasi ini mengingatkan pada pengamatan sebelumnya tentang rentang dinamis perubahan JA yang disebabkan oleh herbivora, dan telah mempertahankan nilai yang sangat tinggi dalam satu populasi (26, 36). Dengan make JA dan JA-Ile buat ngetes korelasi tingkat keseluruhan antara Hj dan δj, kite nemuin kalo ada korelasi positif yang signifikan antara JA dan indeks keragaman dan spesialisasi metabolom β (Gambar S7). Ini nunjukin kalo heterogenitas yang diinduksi herbivora dalam induksi JA yang terdeteksi di tingkat populasi mungkin disebabkan oleh polimorfisme metabolisme kunci yang disebabkan oleh seleksi dari herbivora serangga.
Penelitian sebelumnya udah nunjukin kalo jenis tembakau beda banget dalam jenis dan ketergantungan relatif pada pertahanan metabolisme yang diinduksi dan konstitutif. Dipercaya bahwa perubahan dalam transduksi sinyal anti-herbivora dan kemampuan pertahanan diatur oleh tekanan populasi serangga, siklus hidup tanaman, dan biaya produksi pertahanan di ceruk di mana spesies tertentu tumbuh. Kita mempelajari konsistensi remodeling metabolom daun yang diinduksi oleh herbivora dari enam spesies Nicotiana asli Amerika Utara dan Amerika Selatan. Spesies ini terkait erat dengan Nepenthes Amerika Utara, yaitu Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. rumput yang dilemahkan, Nicotiana tabacum, tembakau linier, tembakau (Nicotiana spegazzinii) dan tembakau daun tembakau (Nicotiana obtusifolia) (Gambar 5A) (37). Enam dari spesies ini, termasuk spesies N. please yang dicirikan dengan baik, adalah tanaman tahunan dari clade petunia, dan obtusifolia N. adalah tanaman abadi dari clade saudara Trigonophyllae (38). Setelah itu, induksi W + W, W + OSM dan W + OSS1 dilakukan pada tujuh spesies ini untuk mempelajari penataan ulang metabolisme tingkat spesies dari makan serangga.
(A) Pohon filogenetik bootstrap berdasarkan kemungkinan maksimum [untuk sintesis glutamin nuklir (38)] dan distribusi geografis tujuh spesies Nicotiana yang terkait erat (warna yang berbeda) (37). (B) Plot hamburan keragaman khusus untuk profil metabolisme tujuh spesies Nicotiana (939 MS/MS; file data S1). Di tingkat spesies, keragaman metabolom berkorelasi negatif dengan tingkat spesialisasi. Analisis korelasi tingkat spesies antara keragaman metabolisme dan spesialisasi dan akumulasi JA ditunjukin di Gambar 2. S9. Warna, beda jenis; segitiga, W + OSS1; persegi panjang, W + OSM; (C) Dinamika Nicotiana JA dan JA-Ile diperingkat sesuai amplitudo eksitasi OS (ANOVA dua arah dan Tukey HSD pasca-perbandingan berganda, * P <0,05, ** P <0,01 dan * ** Untuk perbandingan W + OS dan W + W, P <0,001). Plot kotak dari (D) keragaman dan (E) spesialisasi dari setiap spesies setelah mensimulasikan herbivora dan metil JA (MeJA). Tanda bintang nunjukin perbedaan signifikan antara W + OS dan W + W atau lanolin plus W (Lan + W) atau Lan plus MeJA (Lan + MeJa) dan kontrol Lan (analisis varians dua arah, diikuti oleh perbandingan ganda post hoc HSD Tukey, *P<0.05, **P<0.01 dan ***P<0.01).
Pake metode dual cluster, kite identifikasi 9 modul dari 939 MS/MS (file data S1). Komposisi MS/MS yang dikonfigurasi ulang oleh perlakuan yang berbeda bervariasi banget di antara modul yang berbeda antar spesies (Gambar S8). Ngebayangin Hj (disebut di sini sebagai keanekaragaman γ tingkat spesies) dan δj ngungkapin kalo spesies yang berbeda beragregasi ke dalam kelompok yang sangat berbeda di ruang metabolisme, di mana pembagian tingkat spesies biasanya lebih menonjol daripada eksitasi. Kecuali N. linear dan N. obliquus, mereka menunjukkan berbagai efek induksi dinamis (Gambar 5B). Sebaliknya, spesies seperti N. purpurea dan N. obtusifolia memiliki respon metabolisme yang kurang jelas terhadap pengobatan, tetapi metabolom lebih beragam. Distribusi spesifik spesies dari respon metabolisme yang diinduksi menghasilkan korelasi negatif yang signifikan antara spesialisasi dan keragaman gamma (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Perubahan yang diinduksi OS dalam tingkat JA berkorelasi positif dengan spesialisasi metabolom, dan berkorelasi negatif dengan keragaman gamma metabolisme yang dipamerkan oleh setiap spesies (Gambar 5B dan Gambar S9). Perlu dicatet kalo spesies yang secara sehari-hari disebut sebagai spesies "respons sinyal" di Gambar 5C, seperti nematoda Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes akut, dan Nepenthes melemah, menyebabkan tanda-tanda yang signifikan pada 30 menit. Wabah JA dan JA-Ile spesifik OS baru-baru ini, sementara bakteri lain yang disebut "signal unresponsive", seperti Nepenthes mills, Nepenthes powdery dan N. obtusifolia hanya menunjukkan induksi JA-Ile Edge tanpa spesifisitas OS (Gambar 5C). Di tingkat metabolisme, seperti yang disebutkan di atas, untuk Nepenthes yang dilemahkan, zat-zat yang responsif sinyal menunjukkan spesifisitas OS dan secara signifikan meningkatkan δj, sambil mengurangi Hj. Efek priming spesifik OS ini kagak terdeteksi di spesies yang diklasifikasikan sebagai spesies non-reaktif sinyal (Gambar 5, D dan E). Metabolit spesifik OS lebih sering dibagikan antara spesies yang responsif sinyal, dan kelompok sinyal ini berkelompok dengan spesies dengan respon sinyal yang lebih lemah, sementara spesies dengan respon sinyal yang lebih lemah menunjukkan saling ketergantungan yang lebih sedikit (Gambar S8). Hasil ini nunjukin kalo induksi spesifik OS dari JA dan konfigurasi ulang spesifik OS dari metabolom hilir digabungin di tingkat spesies.
Berikutnye, kite make pasta lanolin yang mengandung metil JA (MeJA) buat ngobatin tanaman buat nyelidikin apakah mode penggabungan ini dibatasi oleh ketersediaan JA yang diterapkan oleh JA eksogen, yang bakal ada di sitoplasma tanaman. Deesterifikasi cepat adalah JA. Kita nemuin tren yang sama dari perubahan bertahap dari spesies yang responsif sinyal ke spesies yang kagak responsif sinyal yang disebabkan oleh pasokan JA yang terus menerus (Gambar 5, D dan E). Singkatnya, perawatan MeJA sangat memprogram ulang metabolom nematoda linier, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens, dan N. mikimotoi, yang menghasilkan peningkatan δj yang signifikan dan penurunan Hj. N. purpurea cuma nunjukin peningkatan δj, tapi kagak Hj. N. obtusifolia, yang sebelumnya udah terbukti menumpuk tingkat JA yang sangat rendah, juga merespon buruk terhadap perawatan MeJA dalam hal rekonfigurasi metabolom. Hasil ini nunjukin kalo produksi JA atau transduksi sinyal secara fisiologis terbatas pada spesies yang kagak merespon sinyal. Buat ngetes hipotesis ini, kite mempelajari empat spesies (N. pallens, N. mills, N. pink dan N. microphylla) yang diinduksi oleh W + W, W + OSMs dan W + OSS1 Transcriptome (39). Konsisten dengan pola remodeling metabolom, spesies terpisah dengan baik di ruang transkriptom, di antaranya N. attenuated menunjukkan RDPI yang diinduksi OS tertinggi, sementara N. gracilis memiliki yang terendah (Gambar 6A). Namun, ditemukan bahwa keragaman transkriptom yang diinduksi oleh N. oblonga adalah yang terendah di antara empat spesies, bertentangan dengan keragaman metabolomik tertinggi N. oblonga yang sebelumnya ditunjukkan pada tujuh spesies. Penelitian sebelumnya udah nunjukin kalo seperangkat gen yang terkait dengan sinyal pertahanan awal, termasuk sinyal JA, menjelaskan spesifisitas respons pertahanan awal yang diinduksi oleh elicitor terkait herbivora pada spesies Nicotiana (39). Membandingkan jalur pensinyalan JA antara empat spesies ini mengungkapkan pola yang menarik (Gambar 6B). Kebanyakan gen di jalur ini, seperti AOC, OPR3, ACX dan COI1, menunjukkan tingkat induksi yang relatif tinggi di empat spesies ini. Namun, gen kunci, JAR4, mengubah JA menjadi bentuk transkrip akumulasi JA-Ile yang aktif secara biologis, dan tingkat transkripsinya sangat rendah, terutama di N. mills, Nepenthes pieris dan N. microphylla. Selain itu, cuma transkrip gen AOS lain yang kagak terdeteksi di N. bifidum. Perubahan ekspresi gen ini mungkin bertanggung jawab atas fenotipe ekstrim yang diinduksi oleh produksi JA yang rendah pada spesies anergik sinyal dan induksi N. gracilis.
(A) Analisis teori informasi pemrograman ulang respon transkripsi awal dari empat spesies tembakau yang terkait erat yang diambil sampel 30 menit setelah induksi herbivora. RDPI dihitung dengan membandingkan daun yang diinduksi oleh OS herbivora dengan kontrol luka. Warna-warna itu nunjukin spesies yang beda, dan simbol-simbolnya nunjukin metode pengobatan yang beda. (B) Analisis ekspresi gen di jalur pensinyalan JA di antara empat spesies. Jalur JA yang disederhanakan ditunjukin di sebelah plot kotak. Warna yang beda nunjukin metode pemrosesan yang beda. Tanda bintang nunjukin kalo ada perbedaan yang signifikan antara perlakuan W + OS dan kontrol W + W (untuk uji t Student untuk perbedaan pasangan, *P<0.05, **P<0.01 dan ***P<0.001). OPDA, 12-oxophytodienoic acid; OPC-8: 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenyl)-cyclopentane-1-octanoic acid.
Di bagian terakhir, kite mempelajari gimane remodeling spesifik spesies serangga dari metabolom spesies tanaman yang berbeda bisa tahan terhadap herbivora. Penelitian sebelumnya menekankan genus Nicotiana. Ketahanan mereka terhadap Ms dan larva sangat berbeda (40). Di sini, kite mempelajari hubungan antara model ini dan plastisitas metabolisme mereka. Pake empat spesies tembakau di atas, dan ngetes korelasi antara keragaman dan spesialisasi metabolom yang disebabkan oleh herbivora dan ketahanan tanaman terhadap Ms dan Sl, kami menemukan ketahanan, keragaman dan spesialisasi terhadap generalis Sl All berkorelasi positif, sementara korelasi antara ketahanan terhadap wanita ahli dan spesialisasi lemah, dan korelasi dengan keragaman tidak signifikan (Gambar 10). Mengenai resistensi S1, N. chinensis dan N. gracilis yang dilemahkan, yang sebelumnya ditunjukkan untuk menunjukkan tingkat transduksi sinyal JA dan plastisitas metabolom, memiliki respon yang sangat berbeda terhadap induksi herbivora, dan mereka juga menunjukkan resistensi tinggi yang sama. Seks.
Dalam enam puluh tahun terakhir, teori pertahanan tanaman telah menyediakan kerangka teoritis, didasarkan para peneliti telah memprediksi sejumlah besar evolusi dan fungsi metabolit khusus tanaman. Kebanyakan dari teori-teori ini kagak ngikutin prosedur normal dari kesimpulan yang kuat (41). Mereka ngusulin prediksi kunci (3) di tingkat analisis yang sama. Ketika pengujian prediksi kunci memungkinkan teori-teori spesifik untuk dianalisis, ini akan membuat bidang bergerak maju. Didukung, tapi tolak orang lain (42). Malah, teori baru bikin prediksi di tingkat analisis yang berbeda dan nambahin lapisan pertimbangan deskriptif baru (42). Namun, dua teori yang diusulkan pada tingkat fungsional, MT dan OD, dapat dengan mudah dijelaskan sebagai prediksi penting dari perubahan metabolisme khusus yang disebabkan oleh herbivora: teori OD percaya bahwa perubahan dalam "ruang" metabolisme khusus sangat berarah. Teori MT percaya kalo perubahan ini bakalan kagak berarah dan terletak secara acak di ruang metabolisme, dan cenderung punya metabolit nilai pertahanan yang tinggi. Pemeriksaan prediksi OD dan MT sebelumnya telah diuji menggunakan set sempit senyawa "pertahanan" apriori. Tes-tes metabolit-sentris ini mencegah kemampuan untuk menganalisis luas dan lintasan rekonfigurasi metabolom selama herbivora, dan tidak memungkinkan pengujian dalam kerangka statistik yang konsisten untuk membutuhkan prediksi kunci yang dapat dianggap sebagai keseluruhan. Di sini, kite make teknologi inovatif di metabolomik berdasarkan MS komputasi dan ngelakuin analisis MS dekonvolusi dalam mata uang umum deskriptor teori informasi buat ngetes perbedaan antara kedua yang diusulkan di tingkat metabolomik global. Prediksi kunci dari teori ini. Teori informasi udah diterapkan di banyak bidang, terutama dalam konteks penelitian keanekaragaman hayati dan aliran nutrisi (43). Namun, sejauh yang kite tau, ini adalah aplikasi pertama yang dipake buat ngegambarin ruang informasi metabolisme tanaman dan nyelesain masalah ekologis yang terkait dengan perubahan metabolisme sementara sebagai respons terhadap isyarat lingkungan. Secara khusus, kemampuan metode ini terletak pada kemampuannya untuk membandingkan pola dalam dan antar spesies tanaman untuk memeriksa bagaimana herbivora telah berevolusi dari spesies yang berbeda ke pola makroevolusi antar spesies pada tingkat evolusi yang berbeda. Metabolisme.
Analisis komponen utama (PCA) mengubah kumpulan data multivariat menjadi ruang pengurangan dimensi sehingga tren utama data dapat dijelaskan, sehingga biasanya digunakan sebagai teknik eksplorasi untuk mengurai kumpulan data, seperti metabolom dekonvolusi. Namun, pengurangan dimensi akan kehilangan sebagian konten informasi dalam set data, dan PCA tidak dapat memberikan informasi kuantitatif tentang karakteristik yang sangat relevan dengan teori ekologi, seperti: bagaimana herbivora mengkonfigurasi ulang keragaman di bidang khusus (misalnya, kekayaan, distribusi) dan kelimpahan) metabolit? Metabolit mana yang merupakan prediktor keadaan yang diinduksi dari herbivora tertentu? Dari perspektif spesifisitas, keragaman dan induksibilitas, isi informasi profil metabolit spesifik daun terurai, dan ditemukan bahwa makan herbivora dapat mengaktifkan metabolisme spesifik. Gak disangka, kite ngeliat kalo, seperti yang dijelasin di indikator teori informasi yang diimplementasiin, situasi metabolisme yang dihasilkan memiliki tumpang tindih besar setelah serangan dari dua herbivora (generalis Sl yang diberi makan malam) dan ahli Solanaceae Ms. Meskipun perilaku makan dan konsentrasi mereka berbeda secara signifikan. Inisiator konjugat asam lemak-asam amino (FAC) di OS (31). Dengan make OS herbivora buat ngobatin luka tusuk standar, perawatan herbivora simulasi juga nunjukin tren yang sama. Prosedur standar ini untuk mensimulasikan respon tanaman terhadap serangan herbivora menghilangkan faktor-faktor yang membingungkan yang disebabkan oleh perubahan perilaku makan herbivora, yang menyebabkan berbagai tingkat kerusakan pada waktu yang berbeda (34). FAC, yang diketahui sebagai penyebab utama OSM, mengurangi JAS dan respon hormon tanaman lainnya di OSS1, sementara OSS1 mengurangi ratusan kali (31). Tapi, OSS1 nyebabin tingkat akumulasi JA yang mirip dibandingin OSM. Sebelumnya udah didemonstrasikan kalo respon JA di Nepenthes yang dilemahkan sangat sensitif terhadap OSM, di mana FAC dapat mempertahankan aktivitasnya bahkan jika diencerkan 1:1000 dengan air (44). Oleh karena itu, dibandingkan dengan OSM, meskipun FAC di OSS1 sangat rendah, itu cukup untuk menginduksi wabah JA yang cukup. Penelitian sebelumnya udah nunjukin kalo protein mirip porin (45) dan oligosakarida (46) bisa dijadiin petunjuk molekuler buat memicu respon pertahanan tanaman di OSS1. Namun, masih belom jelas apakah elicitor di OSS1 ini bertanggung jawab atas akumulasi JA yang diamati dalam penelitian saat ini.
Meskipun ada beberapa penelitian yang menggambarkan sidik jari metabolisme diferensial yang disebabkan oleh penerapan herbivora yang berbeda atau JA atau SA eksogen (asam salisilat) (47), tidak ada yang mengganggu gangguan spesifik spesies herbivora dalam jaringan rumput tanaman dan efeknya pada spesifik Dampak keseluruhan metabolisme dipelajari secara sistematis. informasi pribadi. Analisis ini lebih lanjut mengkonfirmasi bahwa koneksi jaringan hormon internal dengan hormon tanaman lain selain JA membentuk spesifisitas reorganisasi metabolisme yang disebabkan oleh herbivora. Secara khusus, kite nemuin kalo ET yang disebabkan oleh OSM secara signifikan lebih besar daripada yang disebabkan oleh OSS1. Mode ini konsisten dengan lebih banyak konten FAC di OSM, yang merupakan kondisi yang diperlukan dan mencukupi untuk memicu ledakan ET (48). Dalam konteks interaksi antara tanaman dan herbivora, fungsi pensinyalan ET pada dinamika metabolit spesifik tanaman masih sporadis dan hanya menargetkan satu kelompok senyawa. Selain itu, kebanyakan penelitian telah menggunakan aplikasi eksogen dari ET atau prekursornya atau berbagai inhibitor untuk mempelajari regulasi ET, di antaranya aplikasi kimia eksogen ini akan menghasilkan banyak efek samping non-spesifik. Sepengetahuan kite, penelitian ini mewakili pemeriksaan sistematis berskala besar pertama tentang peran ET dalam penggunaan ET untuk menghasilkan dan menyadari tanaman transgenik yang rusak untuk mengkoordinasikan dinamika metabolom tanaman. Induksi ET spesifik herbivora pada akhirnya dapat memodulasi respon metabolom. Yang paling signifikan adalah manipulasi transgenik dari gen biosintesis ET (ACO) dan persepsi (ETR1) yang ngungkapin akumulasi de novo spesifik herbivora dari fenolamida. Sebelumnya udah ditunjukin kalo ET bisa nyetel akumulasi nikotin yang diinduksi JA dengan ngatur putrescine N-methyltransferase (49). Tapi, dari sudut pandang mekanis, kagak jelas gimane ET nyetel induksi fenamida. Selain fungsi transduksi sinyal ET, fluks metabolisme juga dapat dialihkan ke S-adenosyl-1-metionine untuk mengatur investasi dalam amida poliaminofenol. S-adenosyl-1-methionine adalah ET dan perantara umum dari jalur biosintesis poliamin. Mekanisme di mana sinyal ET mengatur tingkat fenolamida perlu dipelajari lebih lanjut.
Selama waktu yang lama, karena banyaknya metabolit khusus dengan struktur yang tidak diketahui, perhatian yang intens terhadap kategori metabolisme tertentu tidak dapat secara ketat menilai perubahan temporal keragaman metabolisme setelah interaksi biologis. Saat ini, berdasarkan analisis teori informasi, hasil utama dari akuisisi spektrum MS/MS berdasarkan metabolit yang kagak bias adalah bahwa herbivora yang makan atau mensimulasikan herbivora terus mengurangi keragaman metabolisme keseluruhan metabolom daun sambil meningkatkan tingkat spesialisasinya. Peningkatan sementara dalam spesifisitas metabolom yang disebabkan oleh herbivora dikaitkan dengan peningkatan sinergis dalam spesifisitas transkriptom. Fitur yang paling berkontribusi pada spesialisasi metabolom yang lebih besar ini (memiliki nilai Si yang lebih tinggi) adalah metabolit khusus dengan fungsi herbivora yang dicirikan sebelumnya. Model ini konsisten dengan prediksi teori OD, tapi prediksi MT yang terkait dengan keacakan pemrograman ulang metabolom kagak konsisten. Namun, data ini juga konsisten dengan prediksi model campuran (MT terbaik; Gambar 1B), karena metabolit lain yang tidak dikarakterisasi dengan fungsi pertahanan yang tidak diketahui mungkin masih mengikuti distribusi Si acak.
Pola yang patut diperhatikan yang lebih lanjut ditangkap oleh penelitian ini adalah bahwa dari tingkat evolusi mikro (populasi tanaman tunggal dan tembakau) ke skala evolusi yang lebih besar (spesies tembakau yang terkait erat), tingkat organisasi evolusi yang berbeda berada dalam "pertahanan terbaik" Ada perbedaan yang signifikan dalam kemampuan herbivora. Moore dkk. (20) dan Kessler dan Kalske (1) secara independen mengusulkan untuk mengubah tiga tingkat fungsional keanekaragaman hayati yang awalnya dibedakan oleh Whittaker (50) menjadi perubahan temporal konstitutif dan diinduksi dari keanekaragaman kimia; penulis-penulis ini kagak ngerangkum Prosedur pengumpulan data metabolom skala besar juga kagak ngejelasin cara ngitung keragaman metabolisme dari data-data ini. Di penelitian ini, penyesuaian kecil terhadap klasifikasi fungsional Whittaker akan mempertimbangkan keragaman α-metabolik sebagai keragaman spektrum MS / MS pada tanaman tertentu, dan keragaman β-metabolik sebagai metabolisme intraspesifik dasar dari sekelompok populasi Ruang, dan keragaman γ-metabolik akan menjadi perpanjangan dari analisis spesies serupa.
Sinyal JA penting banget buat berbagai respon metabolisme herbivora. Namun, ada kurangnya pengujian kuantitatif yang ketat dari kontribusi regulasi intraspesifik biosintesis JA terhadap keragaman metabolom, dan apakah sinyal JA adalah situs umum untuk diversifikasi metabolisme yang diinduksi stres pada skala makroevolusi yang lebih tinggi masih sulit dipahami. Kita ngeliat kalo sifat herbivora Nepenthes herbivora menginduksi spesialisasi metabolom dan variasi spesialisasi metabolom dalam populasi spesies Nicotiana dan di antara spesies Nicotiana yang terkait erat secara sistematis berkorelasi positif dengan pensinyalan JA. Selain itu, ketika sinyal JA terganggu, spesifisitas metabolisme yang diinduksi oleh satu genotipe herbivora akan dibatalkan (Gambar 3, C dan E). Karena perubahan spektrum metabolisme dari populasi Nepenthes yang dilemahkan secara alami kebanyakan kuantitatif, perubahan dalam keragaman dan spesifisitas β metabolisme dalam analisis ini mungkin sebagian besar disebabkan oleh eksitasi kuat dari kategori senyawa kaya metabolit. Kelas senyawa ini mendominasi bagian dari profil metabolom dan mengarah ke korelasi positif dengan sinyal JA.
Karena mekanisme biokimia dari spesies tembakau yang terkait erat dengannya sangat berbeda, metabolit secara spesifik diidentifikasi dalam aspek kualitatif, jadi lebih analitis. Pemrosesan teori informasi dari profil metabolisme yang ditangkap mengungkapkan bahwa induksi herbivora memperparah pertukaran antara keragaman gamma metabolisme dan spesialisasi. Sinyal JA berperan penting dalam pertukaran ini. Peningkatan spesialisasi metabolom konsisten dengan prediksi OD utama dan berkorelasi positif dengan sinyal JA, sementara sinyal JA berkorelasi negatif dengan keragaman gamma metabolisme. Model-model ini nunjukin kalo kapasitas OD tanaman terutama ditentukan oleh plastisitas JA, baik pada skala mikroevolusi atau pada skala evolusi yang lebih besar. Percobaan aplikasi JA eksogen yang menghindari cacat biosintesis JA lebih lanjut mengungkapkan bahwa spesies tembakau yang terkait erat dapat dibedakan menjadi spesies yang responsif sinyal dan non-responsif sinyal, sama seperti mode JA dan plastisitas metabolom yang diinduksi oleh herbivora. Spesies non-responsif sinyal kagak bisa merespon karena ketidakmampuan mereka untuk menghasilkan JA endogen dan karena itu tunduk pada batasan fisiologis. Ini mungkin disebabkan oleh mutasi di beberapa gen kunci di jalur pensinyalan JA (AOS dan JAR4 di N. crescens) dari. Hasil ini menyoroti bahwa pola makroevolusi antar spesies ini mungkin terutama didorong oleh perubahan persepsi dan responsivitas hormon internal.
Selain interaksi antara tanaman dan herbivora, eksplorasi keragaman metabolisme terkait dengan semua kemajuan teoritis penting dalam penelitian adaptasi biologis terhadap lingkungan dan evolusi sifat fenotipik kompleks. Dengan peningkatan jumlah data yang diperoleh oleh instrumen MS modern, pengujian hipotesis tentang keragaman metabolisme sekarang dapat melampaui perbedaan metabolit individu / kategori dan melakukan analisis global untuk mengungkapkan pola yang tidak terduga. Dalam proses analisis skala besar, metafora penting adalah ide untuk merancang peta yang berarti yang dapat digunakan untuk menjelajahi data. Oleh karena itu, hasil penting dari kombinasi metabolomik MS/MS dan teori informasi yang kagak bias saat ini adalah bahwa itu menyediakan metrik sederhana yang dapat digunakan untuk membangun peta untuk menelusuri keragaman metabolisme pada skala taksonomi yang berbeda. Ini adalah syarat dasar dari metode ini. Studi evolusi mikro/makro dan ekologi komunitas.
Di tingkat makro-evolusi, inti dari teori ko-evolusi tanaman-serangga dari Ehrlich dan Raven (51) adalah untuk memprediksi bahwa variasi keragaman metabolisme antar spesies adalah penyebab diversifikasi garis keturunan tanaman. Namun, dalam lima puluh tahun sejak publikasi karya mani ini, hipotesis ini jarang diuji (52). Ini sebagian besar disebabkan oleh karakteristik filogenetik dari karakteristik metabolisme yang sebanding di seluruh garis keturunan tanaman jarak jauh. Kelangkaan itu bisa dipake buat ngejangkar metode analisis target. Alur kerja MS/MS saat ini yang diproses oleh teori informasi mengukur kesamaan struktural MS/MS dari metabolit yang tidak diketahui (tanpa pemilihan metabolit sebelumnya) dan mengubah MS/MS ini menjadi seperangkat MS/MS, sehingga dalam metabolisme profesional Model-evolusi makro ini dibandingkan dalam skala klasifikasi. Indikator statistik sederhana. Prosesnye mirip ama analisis filogenetik, yang bisa make alignment urutan buat ngukur laju diversifikasi atau evolusi karakter tanpa prediksi sebelumnya.
Di tingkat biokimia, hipotesis penyaringan Firn dan Jones (53) nunjukin kalo keragaman metabolisme dipertahanin di tingkat yang berbeda buat nyediain bahan baku buat ngejalanin aktivitas biologis dari metabolit yang sebelumnya kagak terkait atau diganti. Metode teori informasi nyediain kerangka kerja di mana transisi evolusi spesifik metabolit yang terjadi selama spesialisasi metabolit dapat diukur sebagai bagian dari proses penyaringan evolusi yang diusulkan: adaptasi aktif biologis dari spesifisitas rendah ke spesifisitas tinggi Metabolit terhambat dari lingkungan tertentu.
Semuanya, di awal-awal biologi molekuler, teori-teori pertahanan tanaman penting dikembangkan, dan metode yang didorong hipotesis deduktif secara luas dianggap sebagai satu-satunya cara kemajuan ilmiah. Ini sebagian besar disebabkan oleh keterbatasan teknis mengukur seluruh metabolom. Meskipun metode yang didorong hipotesis sangat berguna dalam memilih mekanisme kausal lainnya, kemampuan mereka untuk memajukan pemahaman kita tentang jaringan biokimia lebih terbatas daripada metode komputasi yang saat ini tersedia dalam sains data-intensif kontemporer. Oleh karena itu, teori yang kagak bisa diprediksi jauh di luar lingkup data yang ada, jadi rumus hipotetis/siklus uji kemajuan di bidang penelitian kagak bisa dihapus (4). Kita ngeliat kalo alur kerja komputasi metabolomik yang diperkenalkan di sini dapat membangkitkan kembali minat pada masalah baru-baru ini (gimana) dan akhir (kenapa) tentang keragaman metabolisme, dan berkontribusi pada era baru ilmu data yang dipandu secara teoritis. Era itu ngeperiksa ulang teori-teori penting yang menginspirasi generasi sebelumnya.
Pemberian makan herbivora langsung dilakukan dengan membesarkan larva instar kedua atau larva Sl pada satu daun tanaman pitcher berwarna pucat dari satu tanaman mekar mawar, dengan 10 replika tanaman per tanaman. Larva serangga dijepit dengan penjepit, dan sisa jaringan daun dikumpulkan 24 dan 72 jam setelah infeksi dan dibekukan dengan cepat, dan metabolit diekstraksi.
Simulasikan perawatan herbivora dengan cara yang sangat sinkron. Caranya adalah make roda pola kain buat nusuk tiga baris duri di tiap sisi tulang rusuk tengah tiga daun tanaman yang udah ngembang penuh selama tahap pertumbuhan karangan bunga kain, dan langsung olesin 1:5 Diluted Ms. Atau pake jari bersarung tangan buat masukin S1 OS ke luka tusukan. Panen dan olah daun seperti yang dijelaskan di atas. Pake metode yang udah dijelasin sebelumnya buat ngambil metabolit primer dan hormon tanaman (54).
Untuk aplikasi JA eksogen, tiga daun daun dari masing-masing dari enam tanaman mekar mawar dari setiap spesies diolah dengan 20μl pasta lanolin yang mengandung 150μg MeJA (Lan + MeJA), dan 20μl lanolin plus perawatan luka (Lan + W), atau menggunakan 20μl lanolin murni sebagai kontrol. Daun-daun dipanen 72 jam setelah perlakuan, dibekukan dalam nitrogen cair, dan disimpan pada -80°C sampai digunakan.
Empat garis transgenik JA dan ET, yaitu irAOC (36), irCOI1 (55), irACO dan sETR1 (48), telah diidentifikasi dalam kelompok penelitian kami. irAOC sangat menunjukkan penurunan kadar JA dan JA-Ile, sementara irCOI1 kagak sensitif terhadap JA. Dibandingin ama EV, akumulasi JA-Ile meningkat. Sama, irACO bakal ngurangin produksi ET, dan dibandingin ama EV, sETR1, yang kagak peka terhadap ET, bakal ningkatin produksi ET.
Spektrometer laser fotoakustik (Sensor Sense ETD-300 real-time ET sensor) digunain buat ngelakuin pengukuran ET secara non-invasif. Segera setelah perawatan, setengah dari daun dipotong dan dipindahkan ke vial kaca tertutup 4-ml, dan ruang kepala dibiarkan menumpuk dalam waktu 5 jam. Selama pengukuran, setiap vial disiram dengan aliran 2 liter/jam udara murni selama 8 menit, yang sebelumnya telah melewati katalis yang disediakan oleh Sensor Sense untuk menghilangkan CO2 dan air.
Data microarray awalnya dipublikasikan di (35) dan disimpan di National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Comprehensive Database (nomor akses GSE30287). Data yang sesuai dengan daun yang disebabkan oleh perlakuan W + OSMs dan kontrol yang tidak rusak diekstraksi untuk penelitian ini. Intensitas mentahnya adalah log2. Sebelum analisis statistik, garis dasar diubah dan dinormalisasi ke persentil ke-75 make paket perangkat lunak R.
Data sekuensing RNA (RNA-seq) asli dari spesies Nicotiana diambil dari NCBI Short Reading Archives (SRA), nomor proyek adalah PRJNA301787, yang dilaporkan oleh Zhou dkk. (39) dan lanjutin seperti yang dijelasin di (56). Data mentah yang diproses oleh W + W, W + OSM dan W + OSS1 yang sesuai dengan spesies Nicotiana dipilih untuk dianalisis dalam penelitian ini, dan diproses dengan cara berikut: Pertama, pembacaan RNA-seq mentah dikonversi menjadi format FASTQ. HISAT2 mengubah FASTQ ke SAM, dan SAMtools mengubah file SAM menjadi file BAM yang diurutin. StringTie dipake buat ngitung ekspresi gen, dan metode ekspresinya adalah ada fragmen per seribu fragmen basa per juta fragmen transkripsi yang diurutin.
Kolom kromatografi Acclaim (150 mm x 2.1 mm; ukuran partikel 2.2μm) yang dipake dalam analisis dan kolom penjaga 4 mm x 4 mm terdiri dari bahan yang sama. Gradien biner berikut digunakan dalam sistem Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC): 0 hingga 0,5 menit, isokratik 90% A [air deionisasi, 0,1% (v/v) asetonitril dan 0,05% asam formik], 10% B, dan asetonitril 0.05% asam formik); 0.5 sampe 23.5 menit, fase gradien adalah 10% A dan 90% B, masing-masing; 23.5 sampe 25 menit, isokratik 10% A dan 90% B. Laju alirannye 400μl/menit. Untuk semua analisis MS, injeksikan eluen kolom ke dalam quadrupole dan time-of-flight (qTOF) analyzer yang dilengkapi dengan sumber elektrospray yang beroperasi dalam mode ionisasi positif (tegangan kapiler, 4500 V; stop kontak kapiler 130 V; suhu pengeringan 200°C; aliran udara pengeringan 10 detik/liter).
Lakuin analisis fragmen MS / MS (selanjutnya disebut sebagai MS / MS) yang kagak relevan atau kagak bisa dibedain dari data buat dapetin informasi struktural tentang profil metabolisme yang bisa dideteksi secara keseluruhan. Konsep metode MS/MS sembarangan bergantung pada fakta bahwa quadrupole memiliki jendela isolasi massa yang sangat besar [karena itu, anggap semua sinyal rasio massa-ke-muatan (m/z) sebagai fragmen]. Karena alasan ini, karena instrumen Impact II kagak bisa bikin kemiringan CE, beberapa analisis independen dilakukan dengan menggunakan peningkatan nilai energi tabrakan disosiasi yang diinduksi tabrakan (CE). Singkatnya, pertama analisis sampel dengan UHPLC-electrospray ionization/qTOF-MS menggunakan mode spektrometri massa tunggal (kondisi fragmentasi rendah yang dihasilkan oleh fragmentasi in-source), memindai dari m/z 50 hingga 1500 pada frekuensi pengulangan 5 Hz. Pake nitrogen sebagai gas tabrakan buat analisis MS/MS, dan lakuin pengukuran independen di empat tegangan disosiasi yang diinduksi tabrakan yang berbeda berikut: 20, 30, 40, dan 50 eV. Sepanjang proses pengukuran, quadrupole punya jendela isolasi massa terbesar, dari m/z 50 sampe 1500. Ketika m/z badan depan dan percobaan lebar isolasi diatur ke 200, rentang massa secara otomatis diaktifin oleh perangkat lunak operasi instrumen dan 0 Da. Pindai pecahan massa seperti dalam mode massa tunggal. Pake natrium format (50 ml isopropanol, 200 μl asam formik dan 1 ml larutan berair NaOH 1M) buat kalibrasi massa. Pake algoritma kalibrasi presisi tinggi Bruker, file data dikalibrasi setelah jalanin spektrum rata-rata dalam periode waktu tertentu. Pake fungsi ekspor dari perangkat lunak Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Jerman) buat ngerubah file data mentah ke format NetCDF. Set data MS/MS udah disimpan di database metabolomik terbuka MetaboLights (www.ebi.ac.uk) dengan nomor aksesi. MTBLS1471.
Perakitan MS/MS dapat direalisasikan melalui analisis korelasi antara sinyal kualitas MS1 dan MS/MS untuk energi tabrakan rendah dan tinggi dan aturan yang baru diimplementasikan. Skrip R dipake buat ngewujudin analisis korelasi distribusi prekursor ke produk, dan skrip C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) dipake buat ngelaksanain aturan.
Untuk mengurangi kesalahan positif palsu yang disebabkan oleh noise latar belakang dan korelasi palsu yang disebabkan oleh mendeteksi fitur m/z tertentu hanya dalam beberapa sampel, kami menggunakan fungsi "filled peak" dari paket R XCMS (untuk koreksi noise latar belakang) Harus digunakan untuk mengganti intensitas "NA" (puncak yang tidak terdeteksi). Pas fungsi puncak isi dipake, masih banyak nilai intensitas "0" di set data yang bakal ngaruh ke perhitungan korelasi. Terus, kite bandingin hasil pemrosesan data yang didapet pas fungsi puncak diisi dipake dan pas fungsi puncak diisi kagak dipake, dan ngitung nilai kebisingan latar belakang berdasarkan rata-rata yang dikoreksi, dan ganti dengan nilai intensitas ini nilai latar belakang yang dihitung. Kita juga cuma mempertimbangkan fitur yang intensitasnya melebihi tiga kali nilai latar belakang dan menganggapnya sebagai "puncak sejati." Untuk perhitungan PCC, cuma sinyal m/z dari prekursor sampel (MS1) dan set data fragmen dengan setidaknya delapan puncak sejati yang dipertimbangkan.
Kalo intensitas fitur kualitas prekursor di seluruh sampel secara signifikan berkorelasi dengan intensitas yang berkurang dari fitur kualitas yang sama yang kena energi tabrakan rendah atau tinggi, dan fitur itu kagak dicap sebagai puncak isotop oleh CAMERA, itu bisa didefinisikan lebih lanjut. Terus, dengan ngitung semua pasangan prekursor-produk yang mungkin dalam 3 detik (perkiraan jendela waktu retensi untuk retensi puncak), analisis korelasi dilakukan. Cuma pas nilai m/z lebih rendah dari nilai prekursor dan fragmentasi MS/MS terjadi di lokasi sampel yang sama di set data sebagai prekursor dari mana itu berasal, maka itu dianggap sebagai fragmen.
Berdasarkan dua aturan sederhana ini, kite mengecualikan fragmen yang ditentukan dengan nilai m/z yang lebih besar dari m/z prekursor yang diidentifikasi, dan berdasarkan posisi sampel di mana prekursor muncul dan fragmen yang ditentukan. Ini juga mungkin untuk memilih fitur kualitas yang dihasilkan oleh banyak fragmen in-source yang dihasilkan dalam mode MS1 sebagai prekursor kandidat, sehingga menghasilkan senyawa MS / MS yang berlebihan. Untuk mengurangi redundansi data ini, jika kesamaan NDP dari spektrum melebihi 0,6, dan mereka termasuk dalam kromatogram "pcgroup" yang dianotasi oleh CAMERA, kita akan menyatukan mereka. Akhirnya, kite nyatuin keempat hasil CE yang terkait dengan prekursor dan fragmen ke spektrum komposit dekonvolusi akhir dengan memilih puncak intensitas tertinggi di antara semua puncak kandidat dengan nilai m/z yang sama pada energi tabrakan yang berbeda. Langkah-langkah pemrosesan selanjutnya didasarkan pada konsep spektrum komposit dan memperhitungkan kondisi CE yang berbeda yang diperlukan untuk memaksimalkan probabilitas fragmentasi, karena beberapa fragmen hanya dapat dideteksi di bawah energi tabrakan tertentu.
RDPI (30) dipake buat ngitung induksibilitas profil metabolisme. Keragaman spektrum metabolisme (indeks Hj) berasal dari kelimpahan prekursor MS/MS menggunakan entropi Shannon dari distribusi frekuensi MS/MS menggunakan persamaan berikut yang dijelaskan oleh Martínez dkk. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) dimana Pij sesuai dengan frekuensi relatif dari MS/MS ke-i di sampel ke-j (j = 1, 2,..., m) (i = 1, 2, …, m) t).
Spesifisitas metabolisme (indeks Si) didefinisikan sebagai identitas ekspresi dari MS/MS tertentu dalam kaitannya dengan frekuensi antara sampel yang dipertimbangkan. Spesifisitas MS/MS dihitung sebagai Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Pake rumus berikut buat ngukur indeks δj spesifik metabolom dari tiap sampel j, dan rata-rata spesifisitas MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Spektrum MS/MS dijajarin berpasangan, dan kesamaan dihitung berdasarkan dua skor. Pertama, make NDP standar (juga dikenal sebagai metode korelasi kosinus), pake persamaan berikut buat ngeskor kesamaan segmen antara spektrum NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 dimana S1 dan S2 Sesuai, untuk spektrum 1 dan WS1, juga WS2, i2, dan mewakili berat berdasarkan intensitas puncak bahwa perbedaan puncak umum ke-i antara dua spektrum kurang dari 0,01 Da. Beratnya dihitung sebagai berikut: W = [intensitas puncak] m [kualitas] n, m = 0.5, n = 2, seperti yang disarankan oleh MassBank.
Metode penilaian kedua diimplementasikan, yang melibatkan analisis NL bersama antara MS/MS. Untuk tujuan ini, kite make 52 daftar NL yang sering ditemuin selama proses fragmentasi MS secara bersamaan, dan NL yang lebih spesifik (file data S1) yang sebelumnya udah dianotasi untuk spektrum MS/MS dari metabolit sekunder spesies Nepenthes yang melemah ( 9, 26). Bikin vektor biner 1 dan 0 buat tiap MS/MS, sesuai dengan arus dan kagak ada dari beberapa NL masing-masing. Berdasarkan kesamaan jarak Euclidean, skor kesamaan NL dihitung untuk setiap pasangan vektor NL biner.
Buat ngelakuin dual clustering, kite make paket R DiffCoEx, yang didasarin dari ekstensi Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Pake matriks skor NDP dan NL dari spektrum MS/MS, kite make DiffCoEx buat ngitung matriks korelasi komparatif. Pengelompokan biner dilakukan dengan mengatur parameter "cutreeDynamic" ke metode = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T, dan minClusterSize = 10. Kode sumber R dari DiffCoEx diunduh dari file tambahan 1 oleh Tesson dkk. (57); Paket perangkat lunak R WGCNA yang dibutuhin bisa ditemuin di https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Untuk melakukan analisis jaringan molekuler MS/MS, kami menghitung konektivitas spektral berpasangan berdasarkan tipe kesamaan NDP dan NL, dan menggunakan perangkat lunak Cytoscape untuk memvisualisasikan topologi jaringan menggunakan tata letak organik dalam aplikasi ekstensi algoritma tata letak CyFilescape yFiles.
Pake R versi 3.0.1 buat ngelakuin analisis statistik pada data. Signifikansi statistik dinilai menggunakan analisis varians dua arah (ANOVA), diikuti oleh tes post-hoc perbedaan signifikan jujur ​​(HSD) Tukey. Untuk menganalisis perbedaan antara perlakuan herbivora dan kontrol, distribusi dua ekor dari dua kelompok sampel dengan varians yang sama dianalisis menggunakan uji t Student.
Buat bahan tambahan buat artikel ini, tolong liat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, yang memungkinkan penggunaan, distribusi dan reproduksi di media apapun, selama penggunaan akhir bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah bahwa karya aslinya benar. Petunjuk.
Catatan: Kita cuma minta lu buat ngasih alamat email lu biar orang yang lu rekomendasiin ke halaman tau kalo lu pengen mereka ngeliat emailnya dan kalo itu bukan spam. Kita kagak bakalan ngambil alamat email.
Pertanyaan ini dipake buat ngetes apakah lu pengunjung dan mencegah pengiriman spam otomatis.
Teori informasi nyediain mata uang universal buat perbandingan metabolom khusus dan prediksi teori pertahanan uji.
Teori informasi nyediain mata uang universal buat perbandingan metabolom khusus dan prediksi teori pertahanan uji.
©2021 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. semua hak dilindungi. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.