Penyortiran protein di jalur sekresi penting banget buat ngejaga kompartementalisasi sel dan homeostasis. Selain penyortiran yang dimediasi cangkang, peran lipid dalam penyortiran kinesin dalam proses transportasi sekresi adalah pertanyaan dasar yang udah lama yang belum terjawab. Di sini, kite ngelakuin pencitraan real-time resolusi tinggi multiwarna simultan 3D buat ngebuktiin in vivo kalo protein yang baru disintesis glikosilfosfatidilinositol yang diimobilisasi dengan bagian lipid seramida yang panjang banget dikelompokkan dan diklasifikasikan ke dalam situs keluar bersih endoplasma khusus, yang beda dari yang dipake oleh protein transmembran. Selain itu, kite nunjukin kalo panjang rantai ceramide di membran retikulum endoplasma penting banget buat selektivitas penyortiran ini. Penelitian kite nyediain bukti in vivo langsung pertama buat ngeklasifikasiin muatan protein berdasarkan panjang rantai lipid ke situs ekspor selektif di jalur sekresi.
Di sel eukariotik, protein yang disintesis di retikulum endoplasma (ER) kemudian diurutin selama transportasi melalui jalur sekresi untuk pengiriman ke tujuan seluler yang tepat (1). Selain penyortiran yang dimediasi lapisan, udah lama berspekulasi bahwa lipid tertentu juga bisa berfungsi sebagai titik keluar selektif dengan mengkelompokkannya ke dalam domain membran spesifik yang protein spesifik (2-5). Namun, masih kurang bukti in vivo langsung untuk membuktikan mekanisme berbasis lipid yang mungkin ini. Buat nyelesain masalah dasar ini, kite mempelajari di ragi gimane protein berlabuh glikosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-AP) diekspor secara berbeda dari ER. GPI-APs adalah berbagai protein permukaan sel yang terhubung dengan lipid (6, 7). GPI-AP adalah protein yang disekresikan yang nempel di selebaran luar membran plasma melalui bagian glikolipid (jangkar GPI). Mereka nerima jangkar GPI sebagai modifikasi pasca-translasi konservatif di lumen ER (8). Setelah nempel, GPI-AP melewati aparat Golgi (5, 9) dari ER ke membran plasma. Kehadiran jangkar GPI menyebabkan GPI-AP diangkut secara terpisah dari protein yang disekresikan transmembran (termasuk protein membran plasma lainnya) di sepanjang jalur sekresi (5, 9, 10). Di sel ragi, GPI-AP dipisahin dari protein yang disekresikan lainnya di retikulum endoplasma, dan kemudian dikemas ke dalam vesikel unik yang dibungkus oleh kompleks protein lapisan II (COPII) (6, 7). Penentu proses klasifikasi ini dalam proses ekspor ER kagak jelas, tapi dispekulasikan bahwa mekanisme ini mungkin membutuhkan lipid, terutama pemodelan ulang struktural bagian lipid jangkar GPI (5, 8). Di ragi, remodeling lipid GPI dimulai segera setelah GPI nempel, dan dalam banyak kasus, itu menyebabkan ceramide mengikat asam lemak jenuh rantai panjang 26 karbon (C26:0) (11, 12). C26 ceramide adalah ceramide utama yang diproduksi oleh sel ragi sejauh ini. Itu disintesis di ER dan sebagian besar diekspor ke aparat Golgi melalui vesikel COPII (13). Ekspor ER dari GPI-AP secara khusus membutuhkan sintesis seramida yang terus berlanjut (14, 15), dan pada gilirannya, konversi seramida menjadi inositol fosfat seramida (IPC) di aparat Golgi bergantung pada sintesis jangkar GPI (16). Studi biofisika dengan membran buatan telah menunjukkan bahwa keramida rantai asil yang sangat panjang dapat menyatu untuk membentuk domain yang terurut dengan sifat fisik yang unik (17, 18). Data ini mengarah ke hipotesis bahwa C26 ceramide dan GPI-AP dengan C26 ceramide menggunakan sifat fisik mereka untuk menyatu ke daerah yang teratur atau daerah di lingkungan lipid membran ER yang relatif berantakan. Ini terutama terdiri dari gliserolipid pendek dan tak jenuh (C16:1 dan C18:1) (19, 20). Daerah-daerah ini akan secara selektif difokuskan pada situs keluar ER tertentu (ERES), di mana ceramide dan GPI-AP berbasis ceramide dapat diangkut bersama ke Golgi dalam vesikel COPII khusus yang sama (5).
Di penelitian ini, kite udah langsung ngetes mekanisme berbasis lipid ini dengan make mikroskop pencitraan real-time konfokal super-resolusi (SCLIM), yang merupakan teknik mikroskop canggih yang dapat secara bersamaan mengamati protein berlabel fluoresen Gambar tiga warna dan tiga dimensi (3D) memiliki resolusi yang sangat tinggi dan cepat dalam sel hidup (22, 22).
Kita pertama kali nerapin teknologi SCLIM buat ngedefinisiin lebih lanjut gimana GPI-AP normal dengan kelompok ceramida C26 disaring dari protein yang disekresikan transmembran setelah ninggalin ER di S. cerevisiae. Buat ngecek klasifikasi ER, kite make sistem genetik yang bisa langsung ngebayangin kargo yang baru disintesis masuk ke ERES secara in vivo (7, 23). Sebagai kargo, kite milih C26 ceramide berbasis GPI-AP Gas1 yang dilabelin dengan protein fluoresen hijau (GFP) dan protein sekresi transmembran Mid2 yang dilabelin dengan protein fluoresen inframerah dekat (iRFP), yang keduanya menargetkan membran plasma (24-26). Di mutan peka suhu sec31-1, dua kargo ini diekspresikan di bawah promotor yang diinduksi galaktosa dan penanda ERES konstitutif. Di suhu ekstrim (37°C), karena mutasi sec31-1 mempengaruhi fungsi komponen lapisan COPII Sec31 untuk menghambat perkecambahan COPII dan ekspor ER, kargo yang baru disintesis menumpuk di ER (23). Setelah didinginkan ke suhu rendah (24°C), sel mutan sec31-1 pulih dari area sekresi, dan kargo sintetis baru yang terkumpul mulai diekspor dari ER. Visualisasi CLIM nunjukin kalo sebagian besar Gas1-GFP dan Mid2-iRFP yang baru disintesis masih menumpuk di ER sel mutan sec31-1 setelah inkubasi pada 37°C dan kemudian dilepaskan pada 24°C selama 5 menit (Gambar 1). Karena Mid2-iRFP terdistribusi di seluruh membran ER, dan Gas1-GFP terkonsentrasi dan terkumpul di area membran ER yang tidak berlanjut, distribusi mereka sama sekali berbeda (Gambar 1, A sampai C dan Film S1). Selain itu, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1D, kluster Gas1-GFP tidak memiliki Mid2-iRFP. Hasil ini nunjukin kalo GPI-AP dan protein transmembran dipisahin ke daerah membran ER yang berbeda di awal. Gugus Gas1-GFP berdekatan dengan ERES spesifik yang dilabelkan dengan protein lapisan COPII mCherry Sec13 (Gambar 1, E dan F, dan film S1) (23).
Sel sec31-1 mengekspresikan sekresi yang diinduksi galaktosa, rantai asil panjang (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dan protein transmembran Mid2-iRFP (TMP, biru) dan pelabelan ERES Konstruktif Sec13-mCherry (E) ini diinkubasi di menit, dipindahin ke 24°C, dan dicitrain oleh SCLIM 5 menit kemudian. (A sampe C) nunjukin gambar 2D yang digabung atau tunggal dari pesawat (A), gambar proyeksi 2D dari 10 z-section (B) atau gambar belahan sel 3D dari kargo dan penanda ERES (C). Skala bar 1μm (A dan B). Satuan skalanye 0.551μm (C). Gas1-GFP terdeteksi di daerah atau kluster ER yang terpisah, sementara Mid2-iRFP terdeteksi dan didistribusikan di seluruh membran ER (C). (D) Grafik nunjukin intensitas fluoresensi relatif Gas1-GFP dan Mid2-iRFP di kluster Gas1-GFP di sepanjang garis panah putih (kiri). AU, unit sembarangan. (E dan F) mewakili gambar 3D yang menggabungkan barang dan tanda ERES. Gugus Gas1-GFP terdeteksi di dekat ERES spesifik. Satuan skalanye 0.551μm. (F) Panah padat putih menandai kluster Gas1-GFP yang terkait dengan ERES. Panel tengah dan kanan nunjukin gambar 3D yang diperbesar dan tampilan yang diputar dari kluster Gas1-GFP yang dipilih.
Hubungan spasial yang deket antara kluster Gas1-GFP dan ERES spesifik nunjukin kalo Gas1-GFP bisa masuk ke ERES selektif, yang beda dari selektivitas yang dipake Mid2-iRFP buat ninggalin ER. Buat ngatasin kemungkinan ini, kite ngukur rasio ERES cuma buat satu atau dua barang (Gambar 2, A sampe C). Kita nemuin kalo kebanyakan ERES (70%) cuma mengandung satu jenis kargo. Gambar bawah Gambar 2C nunjukin dua contoh khas ERES dengan cuma Gas1-GFP (Gambar 1) atau cuma Mid2-iRFP (Gambar 2). Sebaliknya, sekitar 20% dari ERES mengandung dua kargo yang tumpang tindih di area yang sama. Ditemukan bahwa beberapa ERES (10%) mengandung dua jenis kargo, tetapi mereka terisolasi di area yang jelas berbeda. Oleh karena itu, analisis statistik ini nunjukin kalo setelah ER diekspor, GPI-AP Gas1-GFP dan kargo transmembran Mid2-iRFP dibagi jadi ERES yang berbeda (Gambar 2D). Efisiensi penyortiran ini sangat konsisten dengan analisis biokimia sebelumnya (6) dan penentuan morfologis (7). Kita juga bisa ngeliat perilaku kargo yang dikarantina masuk ke ERES (Gambar 2E dan Film S2). Gambar 2E nunjukin kalo cuma sebagian kecil Gas1-GFP (panel 3) atau Mid2-iRFP (panel 4) yang masuk ke ERES dari satu sisi dan terkurung di area terpisah. Panel 5 dari Gambar 2E nunjukin kalo Gas1-GFP dan Mid2-iRFP kadang-kadang ditemuin di ERES yang sama, tapi mereka masuk dari sisi yang berbeda dan terkonsentrasi di daerah terpisah yang mungkin mewakili vesikel COPII yang berbeda. Kita juga konfirmasi bahwa pemisahan dan klasifikasi yang diamati dari C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 sebagai ERES selektif spesifik karena kargo sekresi transmembran lainnya, protein membran plasma bertanda GFP Axl2 (27), menunjukkan perilaku yang mirip dengan Mid2-iRFP. (Gambar S1 dan Film S3). Axl2-GFP yang baru disintesis didistribusikan melalui membran ER seperti Mid2-iRFP (Gambar S1, A dan B), dan dilokalisasi bersama dengan Mid2-iRFP di sebagian besar ERES (Gambar S1, B hingga D). Panel 1 dan 2 dari Gambar 1. S1C nunjukin dua contoh khas ERES di mana dua kargo transmembran tumpang tindih. Dalam kasus-kasus ini, kedua barang masuk ke ERES bareng-bareng (Gambar S1E, Panel 3 dan Film S3).
Sel sec31-1 yang mengekspresikan sekresi induksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dan Mid2-iRFP (TMP, biru) dan pelabelan ERES konstitutif Sec13-mCherry (ERES, magenta) ditempatkan pada 37 Setelah diinkubasi selama 30 menit pada °C 24 °C, melepaskan ke sekresi ke gambar dan memblokir dengan SCLIM setelah 20 menit. (A sampe C) Gambar proyeksi 2D representatif (A; skala bar, 1μm) atau gambar belahan sel 3D (B dan C; unit skala, 0,456μm) dari kargo dan 10 z-section yang ditandai oleh ERES. Panel bawah di (B) dan panel di (C) nampilin gambar yang diproses buat nampilin cuma barang yang ada di ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) dan Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Panah terbuka: ERES cuma bawa satu kargo (1 sampe 4). Panah abu-abu: ERES berisi kargo terpisah (5). Panah padat putih: ERES yang berisi kargo yang bersamaan. Dibawah: ERES tunggal yang dipilih cuma mengandung Gas1-GFP (1) atau Mid2-iRFP (2). Bar skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf yang dijelasin di (C). Persentase rata-rata ERES yang cuma mengandung satu kargo (Gas1-GFP atau Mid2-iRFP), kargo yang dipisahin dan kargo yang tumpang tindih. Di tiga percobaan independen, n=432 di 54 sel. Error bar = SD. Uji t dua ekor yang kagak berpasangan. *** P = 0.0002. (E) Gambar 3D dari ERES yang dipilih dari kargo yang dikarantina yang ditandai dengan (C). Gas1-GFP (hijau) (3) atau Mid2-iRFP (biru) (4) masuk ke ERES (magenta) dari satu sisi dan dibatasi ke area kecil di dalam ERES. Kadang, kedua jenis kargo masuk ke ERES yang sama (5) dari sisi yang sama dan terbatas di area terisolasi di dalam ERES. Bar skala, 100 nm.
Berikutnye, kite ngetes hipotesis kalo ceramida rantai asil panjang (C26) yang ada di membran ER mendorong pengelompokan dan penyortiran spesifik Gas1 ke dalam ERES selektif. Untuk tujuan ini, kami menggunakan strain ragi yang dimodifikasi GhLag1, di mana dua sintase ceramida endogen Lag1 dan Lac1 digantikan oleh GhLag1 (homolog Lag1 dari kapas), menghasilkan strain ragi dengan strain Ceramide membran sel yang lebih pendek dari tipe liar (Gambar 3A) (28). Analisis spektrometri massa (MS) nunjukin kalo di strain tipe liar, 95% dari total ceramide adalah ceramide berantai panjang banget (C26), sementara di GhLag1, 85% ceramide sangat panjang (C18 dan C16). ), cuma 2% dari ceramide yang panjang banget (C26) rantai ceramide. Meskipun C18 dan C16 ceramides adalah ceramides utama yang terdeteksi di membran GhLag1 sejauh ini, analisis MS juga mengkonfirmasi bahwa jangkar GPI dari Gas1-GFP yang diekspresikan dalam strain GhLag1 mengandung C26 ceramide, yang sebanding dengan lipid tipe liar. Kualitasnya sama (Gambar 3A) (26). Oleh karena itu, ini berarti bahwa enzim pembentukan seramida Cwh43 sangat selektif untuk seramida C26, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 26, ia lebih memilih menggabungkan jangkar GPI dari sejumlah kecil seramida C26 dalam galur GhLag1. S2 (29). Meskipun begitu, membran sel GhLag1 pada dasarnya cuma mengandung C18-C16 ceramide, sementara Gas1-GFP masih punya C26 ceramide. Fakta ini membuat strain ini menjadi alat ideal untuk secara khusus menyelesaikan masalah panjang rantai asil seramida membran di UGD. Peran hipotetis dari kelas dan penyortiran. Terus, kite pertama kali mempelajari kemampuan C26 Gas1-GFP untuk menumpuk dalam kluster di GhLag1 dengan alel mutan peka suhu sec31-1 melalui mikroskop fluoresensi konvensional, di mana hanya rantai panjang (C18-C16) yang ada di membran ER Ceramide (Gambar 3). Kita ngeliat kalo di sec31-1, sebagian besar Gas1-GFP terkonsentrasi dalam kelompok, sementara Gas1-GFP di sec31-1 GhLag1 dengan membran ER ceramide panjang (C18-C16) panjang terutama tidak terkelompok dan terdistribusi di seluruh membran ER. Biar lebih tepat, karena clustering berbasis ceramide C26 terkait erat dengan ERES spesifik (Gambar 1), kami selanjutnya menyelidiki apakah proses ini mungkin juga melibatkan fungsi mekanisme protein ekspor ER. GPI-AP make sistem COPII khusus buat ekspor ER, yang secara aktif diatur oleh remodeling struktural Ted1 dari bagian glikan dari jangkar GPI (30, 31). GPI-glycan rekombinan kemudian dikenali oleh kompleks reseptor kargo transmembran p24, yang pada gilirannya secara selektif merekrut Lst1, yang merupakan isoform spesifik dari subunit pengikat kargo COPII utama Sec24, membentuk COPII kaya GPI-AP Vesikel diperlukan (31-33). Oleh karena itu, kite membangun mutan ganda yang menggabungkan penghapusan protein tunggal ini (komponen kompleks p24 Emp24, enzim remodeling GPI-glikan Ted1 dan subunit COPII spesifik Lst1) dengan strain mutan sec31-1, dan mempelajari mereka Apakah mungkin untuk membentuk Gas1-luster GFP (Gambar 3). Kita ngeliat kalo di sec31-1emp24Δ dan sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP terutama kagak terkelompok dan terdistribusi di seluruh membran ER, seperti yang sebelumnya dilihat di sec31-1 GhLag1, sementara di sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Seperti sec31-1-11. Hasil ini nunjukin kalo selain adanya C26 ceramide di membran ER, pengelompokan Gas1-GFP juga perlu mengikat kompleks p24, dan kagak perlu perekrutan Lst1 spesifik. Terus, kite ngeliat kemungkinan kalo panjang rantai ceramide di membran ER bisa ngatur pengikatan Gas1-GFP ke p24. Namun, kite nemuin kalo kehadiran C18-C16 ceramide di membran kagak ngaruh ke GPI-glikan yang direkonstruksi oleh kompleks p24 (Gambar S3 dan S4, A dan B) atau mengikat GPI-AP dan mengekspor GPI-AP. nyanggupin. Rekrut COPII subtipe Lst1 (Gambar S4C). Oleh karena itu, pengelompokan yang bergantung pada ceramida C26 tidak membutuhkan interaksi protein dengan mekanisme protein ekspor ER yang berbeda, tetapi mendukung mekanisme penyortiran alternatif yang didorong oleh panjang lipid. Terus, kite nganalisis apakah panjang rantai asil seramida di membran ER penting buat klasifikasi Gas1-GFP yang efektif sebagai ERES selektif. Karena Gas1 di strain GhLag1 dengan ceramida rantai pendek ninggalin ER dan masuk ke membran plasma (Gambar S5), kite percaya kalo penyortiran didorong oleh panjang rantai asil ceramida, Gas1 di strain GhLag1 bisa diarahkan dan disilangkan. barang ERES dengan membran yang sama.
(A) Membran sel GhLag1 terutama mengandung ceramida C18-C16 yang lebih pendek, sementara jangkar GPI Gas1-GFP masih memiliki C26 IPC yang sama dengan sel tipe liar. Di atas: analisis panjang rantai asil ceramide di membran sel tipe liar (Wt) dan strain GhLag1p dengan spektrometri massa (MS). Data mewakili persentase dari total ceramide. Rata-rata dari tiga percobaan independen. Error bar = SD. Uji t dua ekor yang kagak berpasangan. **** P ＜0.0001. Panel bawah: Analisis MS dari panjang rantai asil IPC yang ada di jangkar GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) yang diekspresikan dalam strain tipe liar dan GhLag1p. Data mewakili persentase dari total sinyal IPC. Rata-rata dari lima percobaan independen. Error bar = SD. Uji t dua ekor yang kagak berpasangan. ns, kagak penting. P = 0.9134. (B) Mikrograf fluoresensi dari sel sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ dan sec31-1lst1Δ yang mengekspresikan Gas1-GFP yang diinduksi galaktosa diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit dan dilakukan fluoresensi rutin mikroskop setelah 24°C. Panah putih: ER Gas1-GFP cluster. Panah terbuka: Gas1-GFP yang kagak terkelompok didistribusikan di seluruh membran ER, nunjukin pewarnaan cincin inti karakteristik ER. Batang skala, 5μm. (C) Kuantifikasi fotomikrograf yang dijelasin di (B). Persentase rata-rata sel dengan struktur Gas1-GFP bertitik. Di tiga percobaan independen, n≥300 sel. Error bar = SD. Uji t dua ekor yang kagak berpasangan. **** P ＜0.0001.
Buat langsung nyelesain masalah ini, kite ngelakuin visualisasi SCLIM dari Gas1-GFP dan Mid2-iRFP di GhLag1 dengan alel mutan sensitif suhu sec31-1 (Gambar 4 dan Film S4). Setelah ER dipertahankan pada 37°C dan kemudian dilepaskan pada 24°C, sebagian besar Gas1-GFP yang baru disintesis tidak terkelompok dan terdistribusi di seluruh membran ER, seperti yang diamati oleh mikroskop konvensional (Gambar 4, A dan B). Selain itu, persentase besar ERES (67%) termasuk dua jenis kargo yang terletak bersama di dalamnya (Gambar 4D). Panel 1 dan 2 dari Gambar 4C nunjukin dua contoh khas ERES dengan tumpang tindih Gas1-GFP dan Mid2-GFP. Selain itu, kedua barang direkrut ke ERES yang sama (Gambar 4E, panel 3 dan film S4). Oleh karena itu, hasil kami menunjukkan bahwa panjang rantai asil seramida di membran ER adalah penentu penting dari agregasi dan klasifikasi protein ER.
Sel Sec31-1 GhLag1 yang mengekspresikan sekresi yang diinduksi galaktosa, Gas1-GFP (GPI-AP, hijau) dan Mid2-iRFP (TMP, biru) dan Sec13-mCherry berlabel ERES konstitutif (ERES, magenta) Inkubasi pada suhu 37°C. Terusin selama 30 menit, turunin ke 24°C buat ngeluarin sekresi, dan gambar pake SCLIM setelah 20 menit. (A sampe C) Gambar proyeksi 2D representatif (A; skala bar, 1μm) atau gambar belahan sel 3D (B dan C; unit skala, 0,45μm) dari 10 bagian-z yang ditandai oleh kargo dan ERES. Panel bawah di (B) dan panel di (C) nampilin gambar yang diproses buat nampilin cuma barang yang ada di ERES (magenta) [Gas1-GFP (abu-abu) dan Mid2-iRFP (biru muda)]. (C) Panah yang diisi putih: ERES, barang tumpang tindih. Buka panah: ERES cuma ada satu item. Panel bawah: ERES yang dipilih punya barang yang tumpang tindih (1 dan 2) yang ditandai di (C). Bar skala, 100 nm. (D) Kuantifikasi fotomikrograf yang dijelasin di (C). Di unit sec31-1 dan sec31-1 GhLag1, cuma satu kargo (Gas1-GFP atau Mid2-iRFP) yang disertakan, dan persentase rata-rata ERES untuk kargo terisolasi dan kargo tumpang tindih. Di tiga percobaan independen, n = 432 di 54 sel (sec31-1) dan n = 430 di 47 sel (sec31-1 GhLag1). Error bar = SD. Uji t dua ekor yang kagak berpasangan. *** P = 0.0002 (sec31-1) dan ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Gambar 3D dari ERES yang dipilih dengan kargo yang tumpang tindih (3) yang ditandai di (C). Gas1-GFP (hijau) dan Mid2-iRFP (biru) mendekati ERES (magenta) dari sisi yang sama dan tetap di area terbatas ERES yang sama. Bar skala, 100 nm.
Penelitian ini memberikan bukti in vivo langsung bahwa kargo protein berbasis lipid diklasifikasikan ke dalam situs ekspor selektif dalam jalur sekresi, dan mengungkapkan pentingnya panjang rantai asil untuk selektivitas klasifikasi. Pake teknik mikroskop yang kuat dan canggih yang disebut SCLIM, kite nunjukin Gas1-GFP yang baru disintesis (membran plasma utama GPI-AP dengan porsi lipid seramida rantai asil (C26) yang panjang banget) di ragi) Daerah yang terkelompok dalam ER terpisah terkait dengan ERES spesifik, sementara protein transmembran disekresikan melalui membran ERRES (Gambar 1). Selain itu, dua jenis barang ini masuk ke ERES yang berbeda secara selektif (Gambar 2). Panjang rantai asil dari seramida seluler di membran berkurang dari C26 ke C18-C16, kluster Gas1-GFP terganggu ke wilayah ER diskrit, dan Gas1-GFP diarahkan ulang untuk meninggalkan ER dengan protein transmembran melalui ERES yang sama (Gambar 3 dan Gambar 3). 4).
Meskipun GPI-AP make mekanisme protein khusus buat keluar dari ER, kite nemuin kalo pemisahan yang bergantung pada ceramida C26 kagak bergantung pada interaksi protein diferensial yang mungkin mengarah ke spesialisasi ERES (Gambar S4 dan S5). Malah, temuan kite mendukung mekanisme klasifikasi alternatif yang didorong oleh pengelompokan protein berbasis lipid dan pengecualian kargo lain selanjutnya. Pengamatan kite nunjukin kalo daerah Gas1-GFP atau kluster yang terkait dengan ERES spesifik kagak punya protein yang disekresikan transmembran Mid2-iRFP, yang nunjukin kalo kluster GPI-AP yang bergantung pada ceramida C26 bakalan ngebantuin masuknye ke ERES yang bersangkutan, dan pada saat yang sama, mengecualikan sekresi transmembran Sekresi masuk ke ERES khusus ini (Gambar 12 dan RES). Sebaliknya, kehadiran C18-C16 ceramides di membran ER kagak nyebabin GPI-AP buat ngebentuk daerah atau kluster, jadi mereka kagak ngeluarin atau ngegantiin protein yang disekresikan transmembran ke ERES yang sama (Gambar 3 dan 4). . Oleh karena itu, kami mengusulkan bahwa C26 ceramide mendorong pemisahan dan klasifikasi dengan memfasilitasi pengelompokan protein yang terkait dengan ERES spesifik.
Gimane caranya dapetin clustering C26 yang bergantung ke ceramide ke area ER tertentu? Kecenderungan membran ceramide untuk terpisah secara lateral dapat menyebabkan GPI-AP dan C26 ceramide untuk membentuk lipid kecil dan tertib secara instan di lingkungan lipid yang lebih tidak beraturan dari membran ER yang mengandung gliserolipid yang lebih pendek dan tidak jenuh. Kelompok kualitas (17, 18). Gugus-gugus sementara kecil ini dapat lebih lanjut menyatu menjadi gugus-gugus yang lebih besar dan lebih stabil setelah mengikat ke kompleks p24 (34). Sesuai dengan ini, kami menunjukkan bahwa C26 Gas1-GFP perlu berinteraksi dengan kompleks p24 untuk membentuk gugus yang lebih besar yang terlihat (Gambar 3). Kompleks p24 adalah oligomer heterozigot yang terdiri dari empat protein transmembran p24 yang berbeda dalam ragi (35), yang memberikan pengikatan multivalen, yang dapat mengarah ke pengikatan silang dari gugus GPI-AP kecil, sehingga menghasilkan gugus Stabil yang lebih besar (34). Interaksi antara ektodomain protein GPI-AP juga mungkin berkontribusi pada agregasi mereka, seperti yang ditunjukkan selama transportasi Golgi mereka di sel epitel terpolarisasi mamalia (36). Namun, ketika C18-C16 ceramide hadir di membran ER, ketika kompleks p24 mengikat ke Gas1-GFP, gugus terpisah besar tidak akan terbentuk. Mekanisme yang mendasarinya mungkin tergantung pada sifat fisik dan kimia spesifik dari ceramida rantai asil panjang. Studi biofisika membran buatan nunjukin kalo meskipun keramida rantai asil panjang (C24) dan pendek (C18-C16) bisa nyebabin pemisahan fase, cuma keramida rantai asil panjang (C24) yang bisa ngedorong kelengkungan tinggi dan lentur film buat ngebentuk ulang film. Lewat referensi bersama (17, 37, 38). Udah ditunjukin kalo heliks transmembran TMED2, homolog manusia Emp24, secara selektif berinteraksi dengan sphingomyelin berbasis ceramide C18 di lobus sitoplasma (39). Pake simulasi dinamika molekuler (MD), kite nemuin kalo ceramida C18 dan C26 menumpuk di sekitar lobus sitoplasma heliks transmembran Emp24, dan mereka punya preferensi yang mirip (Gambar S6). Perlu dicatet kalo ini nunjukin kalo heliks transmembran Emp24 bisa nyebabin distribusi lipid yang asimetris di membran. Ini adalah hasil baru berdasarkan sel mamalia. Simulasi MD yang mirip juga nunjukin adanya lipid eter (40). Oleh karena itu, kita berspekulasi bahwa C26 ceramide di dua lobus ER26 diperkaya secara lokal. Ketika GPI-AP di lobus luminal langsung mengikat p24 multivalen dan akumulasi C26 ceramide di sekitar p24 di lobus sitoplasma, itu dapat mempromosikan agregasi protein yang menyertai dan kelengkungan membran dihasilkan melalui jari-jari (41), menyebabkan GPI-AP terpisah ke daerah terpisah yang berdekatan dengan daerah ERES, yang juga mendukung daerah melengkung tinggi membran ER (42). Laporan sebelumnya mendukung mekanisme yang diusulkan (43, 44). Pengikatan multivalen oligolektin, patogen atau antibodi ke glikosfingolipid berbasis seramida (GSL) pada membran plasma memicu agregasi GSL besar, meningkatkan pemisahan fase dan menyebabkan deformasi dan internalisasi membran (44). Iwabuchi dll. (43) Ditemukan bahwa dengan adanya rantai asil panjang (C24) tapi bukan pendek (C16), ligan multivalen yang terikat pada GSL lactosylceramide menginduksi pembentukan kluster besar dan invaginasi membran, dan transduksi sinyal yang dimediasi Lyn sitoplasma pada selebaran diinteraksi oleh rantai netropil dalam pasangan.
Di sel epitel terpolarisasi mamalia, konsentrasi jaringan anti-Golgi (TGN) ke tingkat membran plasma apikal ngontrol pemisahan dan penyortiran GPI-AP (10, 45). Agregasi ini didorong oleh oligomerisasi GPI-AP (36), tapi mungkin juga tergantung pada panjang rantai ceramide yang kita temukan dalam ragi. Meskipun GPI-AP mamalia memiliki jangkar berbasis lipid eter, dan struktur kimiani sangat berbeda dari ceramida rantai asil yang sangat panjang, sebuah penelitian baru-baru ini menemukan bahwa kedua lipid memiliki sifat dan fungsi fisik dan kimia yang mirip secara evolusioner (40). Oleh karena itu, bagian lipid eter di sel mamalia mungkin mirip dengan ceramida C26 di ragi, dan perannya adalah untuk berhubungan dengan ceramida rantai panjang di membran untuk mempromosikan agregasi dan penyortiran GPI-AP. Meskipun kemungkinan ini masih perlu diuji secara langsung, temuan sebelumnya mendukung bahwa transportasi keramida rantai asil panjang ke tubuh Golgi tidak dilakukan oleh protein transfer sitoplasma, tetapi bergantung pada sintesis jangkar GPI seperti ragi. Oleh karena itu, mekanisme konservatif evolusioner tampaknya dapat secara selektif bersama-sama mengangkut keramida rantai asil yang sangat panjang dan GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) dalam vesikel transportasi yang sama.
Di sistem sel epitel terpolarisasi ragi dan mamalia, agregasi GPI-AP dan pemisahan dari protein membran plasma lain semua terjadi sebelum mencapai permukaan sel. Paladino dkk. (48) nemuin kalo di TGN sel epitel terpolarisasi mamalia, pengelompokan GPI-AP kagak cuma dibutuhin buat klasifikasi selektif GPI-AP ke membran plasma apikal, tapi juga ngatur organisasi pengelompokan GPI-AP dan aktivitas biologisnya. Permukaan sel. Di ragi, penelitian ini nunjukin kalo C26 ceramide-dependent GPI-AP cluster di ER dapat ngatur organisasi cluster dan aktivitas fungsional GPI-AP di membran plasma (24, 49). Konsisten dengan model ini, sel GhLag1 alergi terhadap inhibitor GPI atau obat yang mempengaruhi integritas dinding sel (28), dan kebutuhan untuk kluster Gas1-GFP fungsional (49) dari seramida ujung yang diproyeksikan dalam kawin sel ragi menunjukkan G� Kemungkinan konsekuensi fisiologis sel hLag1. Kesalahan GPI-AP. Namun, pengujian lebih lanjut apakah organisasi fungsional permukaan sel telah diprogram dari ER dengan metode penyortiran berdasarkan panjang lipid akan menjadi subjek penelitian kami di masa depan.
Strain Saccharomyces cerevisiae yang dipake di karya ini tercantum di Tabel S1. Strain MMY1583 dan MMY1635 dari SCLIM untuk pencitraan sel hidup dibuat di latar belakang W303. Strain yang mengekspresikan Sec13-mCherry dengan tag protein fluoresen dibuat menggunakan metode berbasis reaksi berantai polimerase (PCR) dengan plasmid pFA6a sebagai templat (23). Strain yang mengekspresikan Mid2-iRFP yang dilabelin dengan protein fluoresen di bawah kontrol promotor GAL1 dibuat sebagai berikut. Amplifikasi PCR dari urutan iRFP-KanMx dari vektor pKTiRFP-KAN (hadiah dari E. O'Shea, nomor plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; pengenal sumber daya penelitian (RRID): Addgene_64687) Dan dimasukkan ke dalam endogenous C22. Setelah urutan genom Mid2-iRFP diperkuat dan dikloning ke promotor GAL1, itu diintegrasikan ke situs Not I-Sac I dari plasmid integrasi pRS306. Plasmid pRGS7 yang dihasilkan dilinearkan dengan Pst I untuk diintegrasikan ke lokus URA3.
Gen fusi Gas1-GFP diekspresikan di bawah kontrol promotor GAL1 di plasmid centromere (CEN), yang dibangun sebagai berikut. Urutan Gas1-GFP diperkuat oleh PCR dari plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (hadiah dari L. Popolo) dan dikloning ke situs Xma I-Xho I dari plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (hadiah dari C). Miller; Nomor plasmid Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmid yang dihasilkan diberi nama pRGS6. Gen fusi Axl2-GFP juga diekspresikan di bawah kontrol promotor GAL1 dari vektor pBEVY-GL LEU2, dan konstruksinya adalah sebagai berikut. Urutan Axl2-GFP diperkuat dari plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) dengan PCR, dan dikloning ke situs Bam HI-Pst I dari vektor pBEVY-GL LEU2. Plasmid yang dihasilkan diberi nama pRGS12. Urutan oligonukleotida yang dipake di penelitian ini tercantum di Tabel S2.
Strain ditambahin dengan 0,2% adenin dan 2% glukosa [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] kaya ekstrak ragi protein p (YP) medium (1% ekstrak ragi dan 2% protein ept). (YPR)] atau 2% galaktosa [YP-galaktosa (YPG)] sebagai sumber karbon, atau dalam medium minimal sintetis (0,15% basa nitrogen ragi dan 0,5% amonium sulfat) untuk melengkapi asam amino dan basa yang sesuai yang dibutuhkan untuk nutrisi, dan mengandung 2% glukosi glukosa (2% media glukosa) atau glukosa minimal galaktosa (medium minimal galaktosa sintetis) sebagai sumber karbon.
Untuk pencitraan real-time, sel mutan sec31-1 yang sensitif suhu yang mengekspresikan konstruksi di bawah promotor GAL1 ditumbuhkan di medium YPR pada suhu 24°C semalaman hingga fase mid-log. Setelah diinduksi di YPG pada suhu 24°C selama 1 jam, sel-sel diinkubasi di SG pada suhu 37°C selama 30 menit, dan kemudian ditransfer ke 24°C untuk dilepaskan dari blok sekresi. Concanavalin A dipake buat benerin sel di kaca slide dan dicitrain oleh SCLIM. SCLIM adalah kombinasi dari mikroskop fluoresensi terbalik Olympus IX-71 dan lensa minyak bukaan numerik UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), pemindai konfokal cakram berputar berkecepatan tinggi dan rasio sinyal-ke-noise tinggi (Yokogawa Electric), spektrometer khusus, sistem intensif pencitraan The Thema (Hamamatsu Photonics) bisa nyediain sistem lensa pembesar dengan pembesaran akhir ×266.7 dan kamera perangkat yang dipasangin muatan yang ngaliin elektron (Hamamatsu Photonics) (21). Akuisisi gambar dilakukan oleh perangkat lunak khusus (Yokogawa Electric). Buat gambar 3D, kite make aktuator piezoelektrik yang dibuat khusus buat ngegetarin lensa objektif secara vertikal, dan ngumpulin bagian optik yang jaraknya 100 nm di tumpukan. Gambar Z-stack diubah jadi data voxel 3D, dan fungsi penyebaran titik teoritis yang dipake buat mikroskop konfokal cakram berputar dipake buat pemrosesan dekonvolusi oleh perangkat lunak Volocity (PerkinElmer). Dengan make perangkat lunak Volocity buat otomatis ambang batas analisis ko-lokasi, ERES termasuk kargo diukur. Analisis pindai garis dilakukan menggunakan perangkat lunak MetaMorph (Molecular Devices).
Pake perangkat lunak GraphPad Prism buat nentuin signifikansi statistik. Untuk uji t-Student dua sisi dan uji analisis varians satu arah biasa (ANOVA), perbedaan antar kelompok dianggap memiliki dampak signifikan pada P <0,05 (*).
Untuk mikroskop fluoresensi Gas1-GFP, sel fase log ditumbuhkan semalaman di YPD dan dikumpulkan dengan sentrifugasi, dicuci dua kali dengan saline penyangga fosfat, dan diinkubasi di atas es selama setidaknya 15 menit, dan kemudian dilanjutkan di bawah mikroskop seperti yang dijelaskan sebelumnya Cek (24). Mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) yang dilengkapi dengan lensa objektif, filter L5 (GFP), kamera Hamamatsu dan perangkat lunak Application Suite X (LAS X) digunakan untuk akuisisi. .
Sampel didenaturasi dengan penyangga sampel SDS pada suhu 65°C selama 10 menit, dan kemudian dipisahkan dengan elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (PAGE). Buat analisis imunoblotting, 10 μl sampel dimuat per jalur. Antibodi primer: Pake anti-Gas1 poliklonal kelinci dengan pengenceran 1:3000, anti-Emp24 poliklonal kelinci dengan pengenceran 1:500, dan anti-GFP poliklonal kelinci (hadiah dari H. Riezman) dengan pengenceran 1:3000. Antibodi anti-Pgk1 monoklonal tikus dipake dengan pengenceran 1:5000 (hadiah dari J. de la Cruz). Antibodi sekunder: Horseradish peroksidase (HRP) konjugasi kambing anti-kelinci imunoglobulin G (IgG) yang dipake dengan pengenceran 1:3000 (Pierce). IgG anti-tikus kambing konjugasi HRP digunakan pada pengenceran 1:3000 (Pierce). Zona respon imun diamati dengan metode chemiluminescence dari reagen SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Seperti yang dijelaskan di (31), percobaan imunopresipitasi alami dilakukan pada fraksi ER yang diperkaya. Singkatnya, cuci sel ragi dengan penyangga TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM campuran fenilmetilsulfonil fluorida dan penghambat protease) pada 600 nm (OD600) pada 100 kepadatan optik dua kali. Itu dipecahin pake manik-manik kaca, dan kemudian puing-puing sel dan manik-manik kaca dibuang dengan sentrifugasi. Supernatan kemudian disentrifugasi pada 17,000 g selama 15 menit pada suhu 4°C. Pelet disuspensi ulang di TNE dan saponin digitalis ditambahkan ke konsentrasi akhir 1%. Suspensi diinkubasi selama 1 jam dengan rotasi pada 4°C, dan kemudian komponen yang tidak larut dihilangkan dengan sentrifugasi pada 13.000 g pada 4°C selama 60 menit. Untuk imunopresipitasi Gas1-GFP, pertama-tama pra-inkubasi sampel dengan manik-manik agarose kosong (ChromoTek) pada suhu 4°C selama 1 jam, lalu inkubasi dengan GFP-Trap_A (ChromoTek) pada suhu 4°C selama 3 jam. Manik-manik yang diimunopresipitasi dicuci lima kali dengan TNE yang mengandung 0,2% digoxigenin, dielusi dengan penyangga sampel SDS, dipisahkan pada SDS-PAGE, dan dianalisis dengan imunoblotting.
Seperti yang dijelaskan di (31), penentuan penghubung silang dilakukan pada fraksi ER yang diperkaya. Singkatnya, fraksi ER yang diperkaya diinkubasi dengan 0,5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 menit). Reaksi silang dipadamkan dengan menambahkan glisin (konsentrasi akhir 50 mM, 5 menit, 20°C).
Seperti yang udah dijelasin sebelumnya (50), analisis MS ceramide di strain tipe liar dan GhLag1 dilakukan. Singkatnya, sel ditumbuhin ke fase eksponensial (3 sampe 4 OD600 unit/ml) di YPD pada 30°C, dan 25×107 sel dipanen. Metabolisme mereka dipadamkan dengan asam trikloroasetat. Pake pelarut ekstraksi [etanol, air, eter, piridin dan 4,2 N amonium hidroksida (15:15:5:1:0,018 v/v)] dan 1,2 nmol kualitas C17 standar internal (860517, lipid polar Avanti)). Pake reagen monometilamin [metanol, air, n-butanol dan larutan metilamin (4:3:1:5 v/v)] buat ngelakuin hidrolisis basa ringan dari ekstrak, dan kemudian pake n-butanol jenuh air buat ngilangin garam. Akhirnya, ekstrak disuspensikan kembali dalam pelarut mode positif [kloroform/metanol/air (2:7:1) + 5 mM amonium asetat] dan disuntikkan ke spektrometer massa. Pemantauan multi-reaksi (MRM) dilakukan untuk identifikasi dan kuantifikasi molekul sphingolipid. Spektrometer massa quadrupole tersier TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) dilengkapi dengan sumber ion nanoflow robotik Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) untuk analisis lipid. Energi tabrakan dioptimalkan untuk setiap kategori ceramide. Data MS didapet dalam mode positif. Untuk setiap replikasi biologis, sinyal lipid adalah median dari tiga pengukuran independen.
Seperti yang dijelasin di (31), sel (800×107) yang mengekspresikan Gas1-GFP dilakuin ke imunopresipitasi alami. Gas1-GFP yang dimurnikan dipisahin oleh SDS-PAGE dan ditransfer ke membran poliviniliden fluorida (PVDF). Protein divisualisasikan dengan mewarnai PVDF dengan hitam amida. Pita Gas1-GFP dipotong dari PVDF dan dicuci 5 kali dengan metanol dan sekali dengan air kelas kromatografi cair-MS (LC-MS). Dengan menginkubasi strip membran dengan 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), penyangga dan 500μl campuran natrium nitrit 1 M yang baru dilarutkan pada suhu 37°C selama 3 jam, fraksi lipid dilepaskan dari Gas1-GFP dan dilisis Pelepasan infosofaosin di antara gluteamin dan seramin (51). Setelah itu, strip membran dicuci empat kali dengan air kelas LC-MS, dikeringkan pada suhu kamar, dan disimpan di atmosfer nitrogen pada -80°C sampai dianalisis. Sebagai kontrol, sampel kosong dari membran PVDF digunakan untuk setiap percobaan. Lipid yang diekstrak dari Gas1-GFP kemudian dianalisis oleh MS seperti yang dijelaskan (50). Singkatnya, strip PVDF yang mengandung GPI-lipid disuspensikan kembali dalam 75μl pelarut cetakan negatif [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonium asetat] dan lulus ionisasi elektrospray (ESI)-MRM/MS Analisis spesies sphingolipid (TSQ Vantage). Dalam kasus ini, data MS diperoleh dalam mode ion negatif.
Seperti yang udah disebutin sebelumnya, bagian lipid dari jangkar GPI dipisahin dari [3H]-inositol-labeled GPI-AP (16). Lipid dipisahin dengan kromatografi lapisan tipis make sistem pelarut (55:45:10 kloroform-metanol-0,25% KCl) dan divisualisasikan make FLA-7000 (Fujifilm).
Sel yang mengekspresikan Gas1-GFP (600×107) dicuci dua kali dengan penyangga TNE dengan penyangga TNE, dan dipecah dengan manik-manik kaca, dan kemudian disentrifugasi untuk menghilangkan puing-puing sel dan manik-manik kaca. Supernatan kemudian disentrifugasi pada 17,000 g selama 1 jam pada suhu 4°C. Pelet dicuci di TNE dan diinkubasi dengan 1 U PI-PLC (Invitrogen) di TNE yang mengandung 0,2% saponin digitalis selama 1 jam pada suhu 37°C. Setelah perlakuan enzim, membran dibuang dengan sentrifugasi pada 17.000 g pada suhu 4°C selama 1 jam. Buat imunopresipitasi Gas1-GFP, supernatan diinkubasi dengan GFP-Trap_A (ChromoTek) di 4°C semalaman. Gas1-GFP yang dimurnikan yang dipisahin oleh SDS-PAGE diwarnai dengan biru cemerlang Coomassie. Pita pewarnaan Gas1-GFP dipotong dari abu-abu yang mengelilingi akueduk, dan kemudian setelah alkilasi dengan iodoacetamide dan reduksi dengan dithiothreitol, pencernaan dalam gel dengan tripsin dilakukan. Ekstrak dan keringin peptida triptik dan peptida dengan GPI-glikan. Peptida kering dilarutkan dalam 20 μl air. Suntikkan sebagian (8μl) ke dalam LC. Kolom octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diameter dalem 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Prefektur Aichi, Jepang) dipake buat misahin peptida di bawah kondisi gradien tertentu. Fase bergerak adalah pelarut A (0.08% asam formik) dan pelarut B (0.15% asam formik dalam 80% asetonitril). Sistem Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) dipake buat ngelusi kolom dengan pelarut A dalam waktu 55 menit dengan laju aliran 50 μl min-1 selama 5 menit, dan kemudian konsentrasi pelarut B ditingkatkan jadi 40%. , Amerika Serikat). Eluat terus dimasukin ke sumber ion ESI, dan peptida triptik dan peptida dengan GPI-glikan dianalisis oleh LTQ Orbitrap XL (spektrometer massa perangkap ion linier hibrida-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Di pengaturan MS, tegangan sumber kapiler diatur ke 4.5 kV, dan suhu kapiler transfer dijaga di 300°C. Tegangan kapiler dan tegangan lensa tabung diatur ke 15 V dan 50 V, masing-masing. Data MS diperoleh dalam mode ion positif (resolusi 60,000; akurasi massa 10 bagian per juta) dalam kisaran massa 300/m/z rasio massa/muatan (m/z) 3000. Data MS/MS diperoleh melalui perangkap ion di Orbit LTQ [XL, data pertama, yang bergantung pada digit pertama disosiasi yang disebabkan tabrakan (CID)].
Simulasi MD dilakukan menggunakan perangkat lunak GROMACS (52) dan medan gaya MARTINI 2 (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) kemudian digunakan untuk membangun lapisan ganda yang mengandung dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) dan Cer C18 atau DOPC dan Cer C26. Topologi dan koordinat Cer C26 berasal dari DXCE dengan ngilangin manik-manik ekstra dari ekor sphingosine. Pake proses yang dijelasin di bawah ini buat ngimbangin lapisan ganda dan jalanin, trus pake koordinat terakhir sistem buat ngebangun sistem yang isinya Emp24. Domain transmembran ragi Emp24 (residu 173 sampe 193) dibangun sebagai α-heliks make struktur molekuler alat visual MD (VMD) (58). Terus, setelah ngilangin lipid yang tumpang tindih, protein dibutir kasar dan dimasukin ke lapisan ganda make CHARMM GUI. Sistem akhir berisi 1202 DOPC dan 302 Cer C26 atau 1197 DOPC dan 295 Cer C18 dan Emp24. Ionisasi sistem ke konsentrasi 0.150M. Empat replika independen dibuat untuk dua komposisi lapisan ganda.
Lapisan ganda lipid diseimbangkan menggunakan proses CHARMM GUI, yang melibatkan meminimalkan dan kemudian menyeimbangkan 405.000 langkah, di mana kendala posisi secara bertahap dikurangi dan dihilangkan, dan langkah waktu meningkat dari 0,005 ps menjadi 0,02 ps. Setelah keseimbangan, itu menghasilkan 6 μs dengan langkah waktu 0.02 ps. Setelah masukin Emp24, pake proses GUI CHARMM yang sama buat ngecilin dan ngimbangin sistem, terus jalanin selama 8 detik di produksi.
Untuk semua sistem, selama proses penyeimbangan, tekanan dikontrol oleh barostat Berendsen (59), dan selama proses produksi, tekanan dikontrol oleh barostat Parrinello-Rahman (60). Di semua kasus, tekanan rata-rata adalah 1 bar dan skema kopling tekanan semi-isotropik digunakan. Dalam proses keseimbangan dan produksi, termostat (61) dengan kalibrasi ulang kecepatan digunakan untuk menggabungkan suhu partikel protein, lipid dan pelarut masing-masing. Selama seluruh operasi, suhu target adalah 310K. Interaksi non-ikatan dihitung dengan menghasilkan daftar pasangan menggunakan skema Verlet dengan toleransi penyangga 0,005. Istilah Coulomb dihitung pake medan reaksi dan jarak potong 1.1 nm. Istilah Vander Waals make skema cut-off dengan jarak cut-off 1.1 nm, dan skema cut-off Verlet dipake buat hanyut potensial (62).
Pake VMD, panjang gelombang cutoff antara manik-manik fosfat DOPC atau manik-manik ceramide AM1 dan protein adalah 0,7 nm, dan jumlah lipid yang berinteraksi dengan protein dihitung. Menurut rumus berikut, hitung faktor depletion-enrichment (DE) seperti di (63): faktor DE = (jumlah total lipid dalam protein 0,7) dalam protein 0,7 (jumlah Cer dalam total lipid)
Nilai yang dilaporkan diperoleh sebagai rata-rata, dan bilah kesalahan adalah empat salinan independen dari SE. Signifikansi statistik dari faktor DE dihitung dengan uji t [(averageDE-factor-1)/SE]. Hitung nilai P dari distribusi satu ekor.
Alat GROMACS dipake buat ngitung peta kepadatan lateral 2D dari sistem yang mengandung Emp24 dalam 250 ns terakhir dari jejak. Untuk mendapatkan peta pengayaan/pengurangan ceramide, peta kepadatan Cer dibagi dengan jumlah peta Cer dan DOPC, dan kemudian dibagi dengan konsentrasi Cer di tubuh. Skala peta warna yang sama dipake.
Buat bahan tambahan buat artikel ini, tolong liat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, yang memungkinkan penggunaan, distribusi dan reproduksi di media apapun, selama penggunaan akhir bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah bahwa karya aslinya benar. Petunjuk.
Catatan: Kita cuma minta lu buat ngasih alamat email lu biar orang yang lu rekomendasiin ke halaman tau kalo lu pengen mereka ngeliat emailnya dan kalo itu bukan spam. Kita kagak bakalan ngambil alamat email.
Pertanyaan ini dipake buat ngetes apakah lu pengunjung dan mencegah pengiriman spam otomatis.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Seropez), Logaz Lopez (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan real-time resolusi tinggi 3D ngungkapin pentingnya panjang rantai ceramide buat penyortiran protein di situs output selektif.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Seropez), Logaz Lopez (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Pencitraan real-time resolusi tinggi 3D ngungkapin pentingnya panjang rantai ceramide buat penyortiran protein di situs output selektif.
©2020 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. semua hak dilindungi. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.