Metabolit imunomodulator adalah fitur kunci dari lingkungan mikro tumor (TME), tapi dengan beberapa pengecualian, identitas mereka masih sebagian besar tidak diketahui. Di sini, kite nganalisis tumor dan sel T dari tumor dan ascites pasien dengan karsinoma serous tingkat tinggi (HGSC) untuk ngungkapin metabolom dari kompartemen TME yang berbeda ini. Ascites dan sel tumor punya perbedaan metabolit yang luas. Dibandingin ama ascites, sel T yang infiltrasi tumor secara signifikan diperkaya dengan 1-methylnicotinamide (MNA). Meskipun tingkat MNA di sel T meningkat, ekspresi nikotinamida N-metiltransferase (enzim yang mengkatalisis transfer gugus metil dari S-adenosylmetionine ke nikotinamida) terbatas pada fibroblas dan sel tumor. Secara fungsional, MNA menginduksi sel T untuk mengeluarkan faktor nekrosis tumor sitokin promotor tumor alfa. Oleh karena itu, MNA yang berasal dari TME berkontribusi pada regulasi kekebalan sel T dan mewakili target imunoterapi potensial untuk pengobatan kanker manusia.
Metabolit yang berasal dari tumor dapat memiliki efek penghambat yang mendalam pada kekebalan anti-tumor, dan semakin banyak bukti menunjukkan bahwa mereka juga dapat berfungsi sebagai kekuatan pendorong kunci untuk perkembangan penyakit (1). Selain efek Warburg, karya baru-baru ini udah mulai mencirikan keadaan metabolisme sel tumor dan hubungannya dengan keadaan kekebalan lingkungan mikro tumor (TME). Penelitian pada model tikus dan sel T manusia telah menunjukkan bahwa metabolisme glutamin (2), metabolisme oksidatif (3) dan metabolisme glukosa (4) dapat bertindak secara independen pada berbagai subkelompok sel imun. Beberapa metabolit di jalur ini menghambat fungsi anti-tumor sel T. Udah terbukti kalo blokade koenzim tetrahidrobiopterin (BH4) bisa ngerusak proliferasi sel T, dan peningkatan BH4 di tubuh bisa meningkatkan respon imun anti-tumor yang dimediasi oleh CD4 dan CD8. Selain itu, efek imunosupresif dari kynurenine dapat diselamatkan dengan pemberian BH4 (5). Di glioblastoma mutan isocitrate dehydrogenase (IDH), sekresi enantiometabolic (R)-2-hidroksiglutarat (R-2-HG) menghambat aktivasi sel T, proliferasi dan Aktivitas sitolisis (6). Baru-baru ini, udah ditunjukin kalo metilglioksal, produk sampingan dari glikolisis, diproduksi oleh sel penekan asal myeloid, dan transfer sel T dari metilglioksal dapat menghambat fungsi sel T efektor. Dalam pengobatan, netralisasi metilglioksal dapat mengatasi aktivitas sel penekan berasal dari myeloid (MDSC) dan secara sinergis meningkatkan terapi blokade pos pemeriksaan pada model tikus (7). Penelitian ini secara kolektif menekankan peran kunci metabolit yang berasal dari TME dalam mengatur fungsi dan aktivitas sel T.
Disfungsi sel T udah banyak dilaporkan di kanker ovarium (8). Ini sebagian karena karakteristik metabolisme yang melekat pada hipoksia dan pembuluh darah tumor abnormal (9), yang menghasilkan konversi glukosa dan triptofan menjadi produk sampingan seperti asam laktat dan kynurenine. Laktat ekstraseluler yang berlebihan mengurangi produksi interferon-γ (IFN-γ) dan mendorong diferensiasi subkelompok mielosupresif (10, 11). Konsumsi triptofan secara langsung menghambat proliferasi sel T dan menghambat pensinyalan reseptor sel T (12-14). Meskipun ada pengamatan ini, banyak kerjaan seputar metabolisme kekebalan yang dilakukan dalam kultur sel T in vitro menggunakan media yang dioptimalkan, atau terbatas pada model tikus homolog in vivo, yang keduanya tidak sepenuhnya mencerminkan heterogenitas kanker manusia dan lingkungan makro dan mikro fisiologis.
Fitur umum kanker ovarium adalah penyebaran peritoneum dan munculnya ascites. Akumulasi cairan sel di ascites terkait dengan penyakit lanjut dan prognosis yang buruk (15). Menurut laporan, kompartemen unik ini hipoksik, memiliki tingkat tinggi faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) dan indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), dan diinfiltrasi oleh sel pengatur T dan sel penghambat mieloid (15-18). Lingkungan metabolisme ascites mungkin beda dari tumor itu sendiri, jadi pemrograman ulang sel T di ruang peritoneum kagak jelas. Selain itu, perbedaan kunci dan heterogenitas antara ascites dan metabolit yang ada di lingkungan tumor dapat menghambat infiltrasi sel imun dan fungsi mereka pada tumor, dan penelitian lebih lanjut diperlukan.
Untuk menyelesaikan masalah-masalah ini, kami merancang metode pemisahan sel sensitif dan kromatografi cair tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) untuk mempelajari berbagai jenis sel (termasuk sel T CD4 + dan CD8 +) serta di dalam dan antar tumor Metabolitnya mencakup sel-sel di lingkungan ascites dan tumor yang sama dari pasien. Kita make metode ini bersamaan dengan sitometri aliran dimensi tinggi dan pengurutan RNA sel tunggal (scRNA-seq) untuk memberikan gambaran yang sangat terselesaikan dari status metabolisme populasi kunci ini. Metode ini nunjukin peningkatan signifikan dalam tingkat 1-methylnicotinamide (MNA) di sel T tumor, dan percobaan in vitro nunjukin kalo efek imunomodulasi MNA pada fungsi sel T sebelumnya kagak diketahui. Pada umumnya, metode ini mengungkapkan interaksi metabolisme timbal balik antara tumor dan sel imun, dan memberikan wawasan unik tentang metabolit regulasi imun, yang mungkin berguna untuk pengobatan peluang pengobatan imunoterapi kanker ovarium berbasis sel T.
Kita make sitometri aliran dimensi tinggi buat ngukur pengambilan glukosa secara bersamaan [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) dan aktivitas mitokondria [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (27, 2019) ada di samping penanda khas yang ngebedain sel imun dan populasi sel tumor (Tabel S2 dan Gambar S1A). Analisis ini nunjukin kalo dibandingin ama sel T, ascites dan sel tumor punya tingkat pengambilan glukosa yang lebih tinggi, tapi punya perbedaan yang lebih kecil dalam aktivitas mitokondria. Rata-rata pengambilan glukosa sel tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] adalah tiga hingga empat kali lipat dari sel T, dan rata-rata pengambilan glukosa sel T CD4 + adalah 1,2 kali lipat dari sel CD8 + T, yang menunjukkan limfosit infiltrasi tumor (TIL) memiliki kebutuhan metabolisme yang berbeda bahkan dalam Gambar TAME yang sama (Gambar 1). Sebaliknya, aktivitas mitokondria di sel tumor mirip dengan sel T CD4 +, dan aktivitas mitokondria dari kedua jenis sel lebih tinggi daripada sel T CD8 + (Gambar 1B). Pada umumnya, hasil ini nunjukin tingkat metabolisme. Aktivitas metabolisme sel tumor lebih tinggi daripada sel T CD4 +, dan aktivitas metabolisme sel T CD4 + lebih tinggi daripada sel T CD8 + . Meskipun ada efek-efek ini di seluruh jenis sel, kagak ada perbedaan yang konsisten dalam status metabolisme sel T CD4 + dan CD8 + atau proporsi relatif mereka dalam asma dibandingkan dengan tumor (Gambar 1C). Sebaliknya, di fraksi sel CD45, proporsi sel EpCAM+ di tumor meningkat dibandingkan dengan ascites (Gambar 1D). Kita juga ngeliat perbedaan metabolisme yang jelas antara komponen sel EpCAM+ dan EpCAM. Sel EpCAM+ (tumor) punya pengambilan glukosa dan aktivitas mitokondria yang lebih tinggi daripada sel EpCAM, yang jauh lebih tinggi daripada aktivitas metabolisme fibroblas di sel tumor di TME (Gambar 1, E dan F).
(A dan B) Intensitas fluoresensi median (MFI) dari pengambilan glukosa (2-NBDG) (A) dan aktivitas mitokondria sel T CD4 + (MitoTracker merah tua) (B) Grafik representatif (kiri) dan data yang ditabulasikan (Kanan), sel T CD8 + dan sel tumor EpCAM + CD45 sebagai sit dan tumor. (C) Rasio sel CD4 + dan CD8 + (dari sel T CD3 +) pada asma dan tumor. (D) Proporsi sel tumor EpCAM + di ascites dan tumor (CD45−). (E dan F) EpCAM + CD45-tumor dan EpCAM-CD45-matrix pengambilan glukosa (2-NBDG) (E) dan aktivitas mitokondria (MitoTracker merah tua) (F) grafik representatif (kiri) dan data tabulasi (Kanan) Asma dan sel tumor. (G) Grafik representatif ekspresi CD25, CD137 dan PD1 dengan sitometri aliran. (H dan I) ekspresi CD25, CD137 dan PD1 pada sel T CD4 + (H) dan sel T CD8 + (I). (J dan K) Fenotipe naif, memori sentral (Tcm), efektor (Teff) dan memori efektor (Tem) berdasarkan ekspresi CCR7 dan CD45RO. Gambar representatif (kiri) dan data tabular (kanan) dari sel T CD4 + (J) dan sel T CD8 + (K) pada asma dan tumor. Nilai P ditentukan oleh uji t berpasangan (*P<0.05, **P<0.01 dan ***P<0.001). Garis itu ngewakilin pasien yang cocok (n = 6). FMO, fluoresensi minus satu; MFI, intensitas fluoresensi median.
Analisis lebih lanjut mengungkapkan perbedaan signifikan lain antara status fenotipik sel T yang sangat terselesaikan. Memori yang diaktifin (Gambar 1, G sampe I) dan efektor (Gambar 1, J dan K) di tumor jauh lebih sering daripada ascites (proporsi sel CD3 + T). Sama, nganalisis fenotipe dengan ekspresi penanda aktivasi (CD25 dan CD137) dan penanda depletion [protein kematian sel terprogram 1 (PD1)] nunjukin kalo meskipun karakteristik metabolisme populasi ini berbeda (Gambar S1, B hingga E), Tapi tidak ada perbedaan metabolisme yang signifikan yang secara konsisten diamati antara efek memori naif, atau subset (Gambar S1, F1) GUA). Hasil ini dikonfirmasi dengan menggunakan metode pembelajaran mesin untuk secara otomatis menetapkan fenotipe sel (21), yang lebih lanjut mengungkapkan adanya sejumlah besar sel sumsum tulang (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) di asma pasien (Gambar S2A). Di antara semua jenis sel yang diidentifikasi, populasi sel mieloid ini menunjukkan pengambilan glukosa dan aktivitas mitokondria tertinggi (Gambar S2, B sampai G). Hasil ini menyoroti perbedaan metabolisme yang kuat antara berbagai jenis sel yang ditemukan pada asma dan tumor pada pasien HGSC.
Tantangan utama dalam memahami karakteristik metabolomik TIL adalah perlunya mengisolasi sampel sel T dengan murni, kualitas dan kuantitas yang cukup dari tumor. Penelitian terbaru udah nunjukin kalo metode penyortiran dan pengayaan manik berdasarkan sitometri aliran dapat menyebabkan perubahan profil metabolit seluler (22-24). Buat ngatasin masalah ini, kite ngeoptimalin metode pengayaan manik buat ngisolasi dan ngisolasi TIL dari kanker ovarium manusia yang direseksi secara bedah sebelum dianalisis oleh LC-MS/MS (liat Bahan dan Metode; Gambar 2A). Untuk menilai dampak keseluruhan dari protokol ini pada perubahan metabolit, kami membandingkan profil metabolit sel T yang diaktifkan oleh donor sehat setelah langkah pemisahan manik di atas dengan sel yang tidak dipisahkan manik tetapi tetap di atas es. Analisis kontrol kualitas ini menemukan bahwa ada korelasi tinggi antara kedua kondisi ini (r = 0,77), dan pengulangan teknis dari kelompok 86 metabolit memiliki pengulangan tinggi (Gambar 2B). Oleh karena itu, metode-metode ini dapat melakukan analisis metabolit yang akurat di sel yang menjalani pengayaan tipe sel, sehingga menyediakan platform resolusi tinggi pertama untuk mengidentifikasi metabolit spesifik di HGSC, sehingga memungkinkan orang untuk mendapatkan pemahaman yang lebih dalam tentang spesifisitas sel Program metabolisme seksual.
(A) Diagram skematik pengayaan manik magnetik. Sebelum dianalisis dengan LC-MS/MS, sel-sel akan menjalani tiga putaran pengayaan manik magnetik berturut-turut atau tetap di atas es. (B) Efek dari jenis pengayaan pada kelimpahan metabolit. Rata-rata dari tiga pengukuran untuk setiap jenis pengayaan ± SE. Garis abu-abu mewakili hubungan 1:1. Korelasi intra-kelas (ICC) dari pengukuran berulang yang ditunjukin di label sumbu. NAD, nikotinamida adenin dinukleotida. (C) Diagram skematik alur kerja analisis metabolit pasien. Ascites atau tumor dikumpulkan dari pasien dan diawetkan. Sebagian kecil dari setiap sampel dianalisis dengan sitometri aliran, sementara sampel yang tersisa menjalani tiga putaran pengayaan untuk sel CD4+, CD8+ dan CD45. Fraksi sel ini dianalisis pake LC-MS/MS. (D) Peta panas dari kelimpahan metabolit standar. Dendrogram mewakili pengelompokan jarak Euclidean Ward antar sampel. (E) Analisis komponen utama (PCA) dari peta metabolit sampel, menunjukkan tiga replika dari setiap sampel, sampel dari pasien yang sama dihubungkan oleh garis. (F) PCA dari profil metabolit sampel yang dikondisikan pada pasien (yaitu, menggunakan redundansi parsial); tipe sampel dibatasi oleh lambung cembung. PC1, komponen utama 1; PC2, komponen utama 2.
Berikutnye, kite nerapin metode pengayaan ini buat nganalisis 99 metabolit di fraksi sel CD4 +, CD8 + dan CD45 di asma primer dan tumor dari enam pasien HGSC (Gambar 2C, Gambar S3A dan Tabel S3 dan S4). Populasi yang diminati menyumbang 2% hingga 70% dari sampel besar sel hidup asli, dan proporsi sel bervariasi banget antar pasien. Setelah memisahkan manik-manik, fraksi yang diperkaya (CD4+, CD8+ atau CD45-) menyumbang lebih dari 85% dari semua sel hidup dalam sampel secara rata-rata. Metode pengayaan ini memungkinkan kita untuk menganalisis populasi sel dari metabolisme jaringan tumor manusia, yang mustahil dilakukan dari sampel besar. Pake protokol ini, kite nentuin kalo l-kynurenine dan adenosine, dua metabolit imunosupresif yang dikarakterisasi dengan baik ini meningkat di sel T tumor atau sel tumor (Gambar S3, B dan C). Oleh karena itu, hasil ini menunjukkan kesetiaan dan kemampuan teknologi pemisahan sel dan spektrometri massa kami untuk menemukan metabolit penting secara biologis dalam jaringan pasien.
Analisis kite juga nunjukin pemisahan metabolisme yang kuat dari jenis sel di dalam dan antar pasien (Gambar 2D dan Gambar S4A). Khususnye, dibandingin ama pasien laen, pasien 70 nunjukin karakteristik metabolisme yang beda (Gambar 2E dan Gambar S4B), yang nunjukin kalo mungkin ada heterogenitas metabolisme yang substansial antar pasien. Perlu dicatet kalo dibandingin ama pasien laen (1,2 sampe 2 liter; Tabel S1), jumlah total ascites yang dikumpulin di pasien 70 (80 ml) lebih kecil. Kontrol heterogenitas antar pasien selama analisis komponen utama (misalnya, make analisis redundansi parsial) nunjukin perubahan yang konsisten antara jenis sel, dan jenis sel dan/atau lingkungan mikro dengan jelas diagregasi sesuai dengan profil metabolit (Gambar 2F). Analisis metabolit tunggal menekankan efek-efek ini dan mengungkapkan perbedaan yang signifikan antara jenis sel dan lingkungan mikro. Perlu dicatet kalo perbedaan yang paling ekstrim yang diamati adalah MNA, yang biasanya diperkaya di sel CD45- dan di sel CD4+ dan CD8+ yang menyusup ke tumor (Gambar 3A). Untuk sel CD4 +, efek ini paling jelas, dan MNA di sel CD8 + juga tampaknya sangat dipengaruhi oleh lingkungan. Tapi, ini kagak penting, karena cuma tiga dari enam pasien yang bisa dievaluasi untuk skor CD8+ tumor. Selain MNA, di berbagai jenis sel di asma dan tumor, metabolit lain yang kurang dikarakterisasi di TIL juga kaya secara berbeda (Gambar S3 dan S4). Oleh karena itu, data ini mengungkapkan seperangkat metabolit imunomodulator yang menjanjikan untuk penelitian lebih lanjut.
(A) Kandungan MNA yang dinormalisasi di sel CD4+, CD8+ dan CD45- dari asma dan tumor. Plot kotak nunjukin median (garis), rentang antarkuartil (engsel bingkai) dan rentang data, sampe 1,5 kali rentang antarkuartil (kumis bingkai). Seperti yang dijelasin di Bahan dan Metode Pasien, pake nilai limma pasien buat nentuin nilai P (*P<0.05 dan **P<0.01). (B) Diagram skematik metabolisme MNA (60). Metabolit: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nikotinamida ribosa; NMN, nikotinamida mononukleotida. Enzim (hijau): NNMT, nikotinamida N-metiltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nikotinamida fosforibosil transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nikotinamida ribosida kinase; NMNAT, nikotinamida mono Nukleotida adenilat transferase; Pnp1, purin nukleosida fosforilase. (C) t-SNE dari scRNA-seq ascites (abu-abu) dan tumor (merah; n = 3 pasien). (D) Ekspresi NNMT di populasi sel yang berbeda yang diidentifikasi pake scRNA-seq. (E) Ekspresi NNMT dan AOX1 di SK-OV-3, ginjal embrionik manusia (HEK) 293T, sel T dan sel T yang diobati MNA. Ekspresi yang dilipat ditunjukin relatif ke SK-OV-3. Pola ekspresi dengan SEM ditunjukin (n = 6 donor sehat). Nilai Ct lebih dari 35 dianggap kagak bisa dideteksi (UD). (F) Ekspresi SLC22A1 dan SLC22A2 di SK-OV-3, HEK293T, sel T dan sel T yang diobati dengan 8mM MNA. Ekspresi yang dilipat ditunjukin relatif ke SK-OV-3. Pola ekspresi dengan SEM ditunjukin (n = 6 donor sehat). Nilai Ct lebih dari 35 dianggap kagak bisa dideteksi (UD). (G) Kandungan MNA sel di sel T donor sehat yang diaktifin setelah 72 jam inkubasi dengan MNA. Pola ekspresi dengan SEM ditunjukin (n = 4 donor sehat).
MNA diproduksi dengan mentransfer gugus metil dari S-adenosyl-1-metionine (SAM) ke nikotinamida (NA) oleh nikotinamida N-metiltransferase (NNMT; Gambar 3B). NNMT diekspresikan secara berlebihan di berbagai kanker manusia dan terkait dengan proliferasi, invasi dan metastasis (25-27). Untuk lebih memahami sumber MNA di sel T di TME, kami menggunakan scRNA-seq untuk mengkarakterisasi ekspresi NNMT di seluruh jenis sel pada asma dan tumor tiga pasien HGSC (Tabel S5). Analisis dari sekitar 6.500 sel nunjukin kalo di lingkungan asma dan tumor, ekspresi NNMT dibatasi ke populasi sel fibroblas dan tumor yang dianggap (Gambar 3, C dan D). Perlu dicatet kalo kagak ada ekspresi NNMT yang jelas di populasi yang mengekspresikan PTPRC (CD45 +) (Gambar 3D dan Gambar S5A), yang nunjukin kalo MNA yang terdeteksi di spektrum metabolit udah dimasukin ke sel T. Ekspresi aldehida oksidase 1 (AOX1) mengubah MNA menjadi 1-metil-2-piridon-5-karboksamida (2-PYR) atau 1-metil-4-piridon-5-karboksamida (4-PYR); Gambar 3B) juga dibatasi ke populasi fibroblas yang mengekspresikan COL1A1 (Gambar S5A), yang bersama-sama nunjukin kalo sel T kagak punya kemampuan metabolisme MNA konvensional. Pola ekspresi gen-gen terkait MNA ini diverifikasi menggunakan set data sel independen kedua dari ascites dari pasien HGSC (Gambar S5B; n = 6) (16). Selain itu, analisis reaksi berantai polimerase kuantitatif (qPCR) dari sel T donor sehat yang diobati dengan MNA menunjukkan bahwa dibandingkan dengan sel tumor ovarium SK-OV-3 kontrol, NNMT atau AOX1 hampir tidak diekspresikan (Gambar 3E). Hasil yang kagak terduga ini nunjukin kalo MNA mungkin disekresikan dari fibroblas atau tumor ke sel T yang berdekatan di TME.
Meskipun kandidat termasuk keluarga transporter kation organik 1 sampai 3 (OCT1, OCT2 dan OCT3) yang dikodekan oleh keluarga pembawa larut 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 dan SLC22A3), transporter potensial MNA masih belum didefinisikan (28) . QPCR mRNA dari sel T donor sehat nunjukin tingkat ekspresi SLC22A1 yang rendah tapi tingkat SLC22A2 yang kagak terdeteksi, yang mengkonfirmasi bahwa itu udah dilaporkan sebelumnya di literatur (Gambar 3F) (29). Sebaliknya, garis sel tumor ovarium SK-OV-3 mengekspresikan tingkat tinggi dari kedua transporter (Gambar 3F).
Untuk ngetes kemungkinan sel T punya kemampuan buat nyerep MNA asing, sel T donor sehat dikultur selama 72 jam dengan adanya konsentrasi MNA yang berbeda. Kalo kagak ada MNA eksogen, kandungan seluler MNA kagak bisa dideteksi (Gambar 3G). Namun, sel T yang diaktifkan yang diobati dengan MNA eksogen menunjukkan peningkatan kandungan MNA yang bergantung pada dosis di sel, hingga 6 mM MNA (Gambar 3G). Hasil ini nunjukin kalo meskipun tingkat ekspresi transporter rendah dan kurangnya enzim utama yang bertanggung jawab atas metabolisme MNA intraseluler, TIL masih bisa ngambil MNA.
Spektrum metabolit di sel T pasien dan percobaan penyerapan MNA in vitro meningkatkan kemungkinan bahwa fibroblas terkait kanker (CAF) mengeluarkan MNA dan sel tumor dapat mengatur fenotipe dan fungsi TIL. Buat nentuin efek MNA pada sel T, sel T donor sehat diaktifin in vitro dengan ada atau kagak ada MNA, dan proliferasi dan produksi sitokin mereka dievaluasi. Setelah 7 hari nambahin MNA pada dosis tertinggi, jumlah penggandaan populasi berkurang sedang, sementara kekuatan dipertahankan pada semua dosis (Gambar 4A). Selain itu, pengobatan MNA eksogen menghasilkan peningkatan proporsi sel T CD4 + dan CD8 + yang mengekspresikan faktor nekrosis tumor-α (TNFα; Gambar 4B). Sebaliknya, produksi intraseluler IFN-γ berkurang secara signifikan di sel T CD4 +, tapi kagak di sel T CD8 +, dan kagak ada perubahan yang signifikan di interleukin 2 (IL-2; Gambar 4, C dan D). Oleh karena itu, tes imunosorben terkait enzim (ELISA) dari supernatan dari kultur sel T yang diobati MNA ini menunjukkan peningkatan TNFα yang signifikan, penurunan IFN-γ, dan tidak ada perubahan IL-2 (Gambar 4, E hingga G). . Penurunan IFN-γ nunjukin kalo MNA mungkin berperan dalam menghambat aktivitas anti-tumor sel T. Untuk mensimulasikan efek MNA pada sitotoksisitas yang dimediasi sel T, sel reseptor antigen chimeric T (FRα-CAR-T) yang menargetkan reseptor folat α dan CAR-T (GFP) yang diatur oleh sel protein fluoresen hijau (GFP) -CAR-T) diproduksi oleh sel mononuklear darah perifer donor sehat (PBMC). Sel CAR-T dikultur selama 24 jam dengan adanya MNA, dan kemudian dikultur bersama dengan sel tumor ovarium SK-OV-3 manusia yang mengekspresikan reseptor folat α pada rasio efektor terhadap target 10:1. Perawatan MNA menghasilkan penurunan yang signifikan dalam aktivitas pembunuhan sel FRα-CAR-T, yang mirip dengan sel FRα-CAR-T yang diobati dengan adenosin (Gambar 4H).
(A) Total jumlah sel yang layak dan penggandaan populasi (PD) langsung dari kultur pada hari ke-7. Grafik batang mewakili rata-rata + SEM dari enam donor sehat. Mewakili data dari setidaknya n = 3 percobaan independen. (B sampe D) CD3/CD28 dan IL-2 dipake buat ngaktifin sel T di konsentrasi MNA masing-masing selama 7 hari. Sebelum dianalisis, sel dirangsang dengan PMA/ionomycin dengan GolgiStop selama 4 jam. Ekspresi TNFα (B) di sel T. Contoh gambar (kiri) dan data tabular (kanan) ekspresi TNFα di sel hidup. IFN-γ (C) dan IL-2 (D) ekspresi di sel T. Ekspresi sitokin diukur dengan sitometri aliran. Grafik batang mewakili rata-rata (n = 6 donor sehat) + SEM. Pake analisis varians satu arah dan pengukuran berulang (*P<0.05 dan **P<0.01) buat nentuin nilai P. Mewakili data dari setidaknya n = 3 percobaan independen. (E to G) CD3/CD28 dan IL-2 dipake buat ngaktifin sel T di konsentrasi MNA masing-masing selama 7 hari. Media dikumpulkan sebelum dan sesudah 4 jam stimulasi PMA/ionomycin. Konsentrasi TNFα (E), IFN-γ (F) dan IL-2 (G) diukur dengan ELISA. Grafik batang mewakili rata-rata (n = 5 donor sehat) + SEM. Nilai P ditentukan pake analisis varians satu arah dan pengukuran berulang (*P<0.05). Garis putus-putus nunjukin batas deteksi deteksi. (H) Assay lisis sel. Sel FRα-CAR-T atau GFP-CAR-T disesuaikan dengan adenosin (250μM) atau MNA (10 mM) selama 24 jam, atau dibiarin kagak diobati (Ctrl). Persentase pembunuhan sel SK-OV-3 diukur. Nilai P ditentukan oleh uji t Welch (*P<0.5 dan **P<0.01).
Untuk mendapatkan pemahaman mekanis tentang regulasi ekspresi TNFα yang bergantung pada MNA, perubahan mRNA TNFα dari sel T yang diobati MNA dievaluasi (Gambar 5A). Sel T donor sehat yang diobati dengan MNA nunjukin peningkatan dua kali lipat dalam tingkat transkripsi TNFα, yang nunjukin kalo MNA bergantung pada regulasi transkripsi TNFα. Buat nyelidikin mekanisme regulasi yang mungkin ini, dua faktor transkripsi yang diketahui yang ngatur TNFα, yaitu faktor inti sel T yang diaktifin (NFAT) dan protein spesifik 1 (Sp1), dievaluasi sebagai respons terhadap pengikatan MNA ke promotor TNFα proksimal ( 30). Promotor TNFα mengandung 6 situs pengikatan NFAT yang diidentifikasi dan 2 situs pengikatan Sp1, tumpang tindih di satu situs [-55 pasangan basa (bp) dari 5'cap] (30). Imunopresipitasi kromatin (ChIP) nunjukin kalo pas diobati dengan MNA, pengikatan Sp1 ke promotor TNFα meningkat tiga kali lipat. Penggabungan NFAT juga meningkat dan mendekati kepentingan (Gambar 5B). Data ini nunjukin kalo MNA ngatur ekspresi TNFα lewat transkripsi Sp1, dan ekspresi NFAT yang lebih rendah.
(A) Dibandingin ama sel T yang dikultur tanpa MNA, perubahan lipatan ekspresi TNFα di sel T yang diobati dengan MNA. Pola ekspresi dengan SEM ditunjukin (n = 5 donor sehat). Mewakili data dari setidaknya n = 3 percobaan independen. (B) Promotor TNFα dari sel T yang diobati dengan atau tanpa 8 mM MNA setelah NFAT dan Sp1 dikombinasikan dengan (Ctrl) dan stimulasi PMA/ionomycin selama 4 jam. Imunoglobulin G (IgG) dan H3 digunakan sebagai kontrol negatif dan positif untuk imunopresipitasi, masing-masing. Kuantifikasi ChIP nunjukin kalo pengikatan Sp1 dan NFAT ke promotor TNFα di sel yang diobati MNA meningkat beberapa kali dibandingin ama kontrol. Mewakili data dari setidaknya n = 3 percobaan independen. Nilai P ditentukan oleh beberapa uji t (*** P <0.01). (C) Dibandingin ama asma HGSC, sel T (non-sitotoksik) nunjukin peningkatan ekspresi TNF di tumor. Warna-warna itu mewakili pasien yang berbeda. Sel yang ditampilkan telah disampel secara acak ke 300 dan dijitter untuk membatasi overdrawing (** Padj = 0.0076). (D) Model MNA yang diusulkan untuk kanker ovarium. MNA diproduksi di sel tumor dan fibroblas di TME dan diambil oleh sel T. MNA meningkatkan pengikatan Sp1 ke promotor TNFα, yang mengarah ke peningkatan transkripsi TNFα dan produksi sitokin TNFα. MNA juga nyebabin penurunan IFN-γ. Penghambatan fungsi sel T menyebabkan kemampuan membunuh yang berkurang dan pertumbuhan tumor yang mempercepat.
Menurut laporan, TNFα punya efek anti-tumor dan anti-tumor yang bergantung di depan dan belakang, tapi punya peran yang terkenal dalam mempromosikan pertumbuhan dan metastasis kanker ovarium (31-33). Menurut laporan, konsentrasi TNFα di asma dan jaringan tumor pada pasien kanker ovarium lebih tinggi daripada jaringan jinak (34-36). Dari segi mekanisme, TNFα dapat mengatur aktivasi, fungsi dan proliferasi sel darah putih, dan mengubah fenotipe sel kanker (37, 38). Konsisten dengan temuan ini, analisis ekspresi gen diferensial menunjukkan bahwa TNF secara signifikan diatur ke atas di sel T di jaringan tumor dibandingkan dengan ascites (Gambar 5C). Peningkatan ekspresi TNF cuma keliatan di populasi sel T dengan fenotipe non-sitotoksik (Gambar S5A). Kesimpulannye, data ini mendukung pandangan bahwa MNA memiliki efek imunosupresif dan promosi tumor ganda di HGSC.
Pelabelan fluoresen berdasarkan sitometri aliran telah menjadi metode utama untuk mempelajari metabolisme TIL. Penelitian ini udah nunjukin kalo dibandingin ama limfosit darah tepi atau sel T dari organ limfoid sekunder, TIL tikus dan manusia punya kecenderungan yang lebih tinggi buat nyerap glukosa (4, 39) dan hilangnya fungsi mitokondria secara bertahap (19, 40). Meskipun kite udah ngeliat hasil yang mirip di penelitian ini, perkembangan kuncinye adalah ngebandingin metabolisme sel tumor dan TIL dari jaringan tumor yang sama yang dipotong. Konsisten dengan beberapa laporan sebelumnya, sel tumor (CD45-EpCAM +) dari asma dan tumor memiliki pengambilan glukosa yang lebih tinggi daripada sel T CD8 + dan CD4 +, mendukung bahwa pengambilan glukosa tinggi dari sel tumor dapat dibandingkan dengan sel T. Konsep persaingan sel T. TME. Namun, aktivitas mitokondria sel tumor lebih tinggi daripada sel T CD8 +, tapi aktivitas mitokondria mirip dengan sel T CD4 +. Hasil ini memperkuat tema yang muncul bahwa metabolisme oksidatif penting untuk sel tumor (41, 42). Mereka juga nyaranin kalo sel T CD8 + mungkin lebih rentan terhadap disfungsi oksidatif daripada sel T CD4 +, atau sel T CD4 + mungkin make sumber karbon selain glukosa buat ngejaga aktivitas mitokondria (43, 44). Perlu dicatet kalo kite kagak ngeliat perbedaan dalam pengambilan glukosa atau aktivitas mitokondria antara efektor CD4 + T, memori efektor T dan sel memori pusat T pada asma. Sama, keadaan diferensiasi sel T CD8 + di tumor kagak ada hubungannye ama perubahan pengambilan glukosa, menyoroti perbedaan signifikan antara sel T yang dikultur in vitro dan TIL manusia in vivo (22). Pengamatan ini juga dikonfirmasi dengan penggunaan alokasi populasi sel otomatis yang tidak bias, yang lebih lanjut mengungkapkan bahwa sel CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + dengan pengambilan glukosa dan aktivitas mitokondria yang lebih tinggi daripada sel tumor lazim tetapi memiliki populasi sel aktif Metabolik. Populasi ini mungkin mewakili subpopulasi putatif dari sel penekan mieloid atau sel dendritik plasmasitoid yang diidentifikasi dalam analisis scRNA-seq. Meskipun keduanya udah dilaporkan di tumor ovarium manusia [45], mereka masih butuh Kerjaan lebih lanjut adalah untuk mendeskripsikan subpopulasi myeloid ini.
Meskipun metode berbasis sitometri aliran dapat mengklarifikasi perbedaan umum glukosa dan metabolisme oksidatif antara jenis sel, metabolit tepat yang diproduksi oleh glukosa atau sumber karbon lain untuk metabolisme mitokondria di TME belum ditentukan. Menetapkan ada atau tidaknya metabolit ke subset TIL tertentu membutuhkan pemurnian populasi sel dari jaringan yang dipotong. Oleh karena itu, metode pengayaan sel kami dikombinasikan dengan spektrometri massa dapat memberikan wawasan tentang metabolit yang secara berbeda diperkaya dalam populasi sel T dan sel tumor dalam sampel pasien yang cocok. Meskipun metode ini punya keuntungan dibandingin penyortiran sel yang diaktifin fluoresensi, perpustakaan metabolit tertentu mungkin terpengaruh karena stabilitas yang melekat dan / atau laju pergantian yang cepat (22). Namun demikian, metode kami dapat mengidentifikasi dua metabolit imunosupresif yang dikenal, adenosin dan kynurenine, karena mereka sangat bervariasi antara jenis sampel.
Analisis metabolomik kami tentang tumor dan subtipe TIL memberikan lebih banyak wawasan tentang peran metabolit dalam TME ovarium. Pertama, make sitometri aliran, kite nentuin kalo kagak ada perbedaan aktivitas mitokondria antara tumor dan sel T CD4 +. Namun, analisis LC-MS/MS mengungkapkan perubahan signifikan dalam kelimpahan metabolit di antara populasi ini, yang menunjukkan bahwa kesimpulan tentang metabolisme TIL dan aktivitas metabolisme secara keseluruhan membutuhkan interpretasi yang cermat. Kedua, MNA adalah metabolit dengan perbedaan terbesar antara sel CD45 dan sel T pada ascites, bukan tumor. Oleh karena itu, kompartementalisasi dan lokasi tumor mungkin memiliki efek yang berbeda pada metabolisme TIL, yang menyoroti kemungkinan heterogenitas dalam lingkungan mikro tertentu. Ketiga, ekspresi enzim penghasil MNA NNMT terutama terbatas pada CAF, yang merupakan sel tumor pada tingkat yang lebih rendah, tetapi kadar MNA yang dapat dideteksi diamati pada sel T yang berasal dari tumor. Ekspresi berlebihan NNMT di CAF ovarium memiliki efek promotor kanker yang diketahui, sebagian karena promosi metabolisme CAF, invasi tumor dan metastasis (27). Meskipun tingkat TIL secara keseluruhan sedang, ekspresi NNMT di CAF terkait erat dengan subtipe mesenkim Cancer Genome Atlas (TCGA), yang terkait dengan prognosis yang buruk (27, 46, 47). Akhirnya, ekspresi enzim AOX1 yang bertanggung jawab atas degradasi MNA juga terbatas pada populasi CAF, yang menunjukkan bahwa sel T kurang kemampuan untuk memetabolisme MNA. Hasil ini mendukung ide bahwa meskipun perlu kerja lebih lanjut untuk memverifikasi temuan ini, tingkat tinggi MNA di sel T mungkin menunjukkan adanya lingkungan mikro CAF imunosupresif.
Mengingat tingkat ekspresi transporter MNA yang rendah dan tingkat protein kunci yang terlibat dalam metabolisme MNA yang kagak terdeteksi, kehadiran MNA di sel T kagak terduga. NNMT atau AOX1 kagak bisa dideteksi oleh analisis scRNA-seq dan qPCR yang ditargetkan dari dua kohort independen. Hasil ini nunjukin kalo MNA kagak disintesis oleh sel T, tapi diserap dari TME di sekitarnya. Percobaan in vitro nunjukin kalo sel T cenderung menumpuk MNA eksogen.
Penelitian in vitro kite udah nunjukin kalo MNA eksogen menginduksi ekspresi TNFα di sel T dan meningkatkan pengikatan Sp1 ke promotor TNFα. Meskipun TNFα punya fungsi anti-tumor dan anti-tumor, di kanker ovarium, TNFα dapat mempromosikan pertumbuhan kanker ovarium (31-33). Netralisasi TNFα di kultur sel tumor ovarium atau penghapusan sinyal TNFα di model tikus dapat meningkatkan produksi sitokin inflamasi yang dimediasi TNFα dan menghambat pertumbuhan tumor (32, 35). Oleh karena itu, dalam hal ini, MNA yang berasal dari TME dapat bertindak sebagai metabolit pro-inflamasi melalui mekanisme yang bergantung pada TNFα melalui loop autokrin, sehingga mempromosikan terjadinya dan penyebaran kanker ovarium (31). Berdasarkan kemungkinan ini, blokade TNFα sedang dipelajari sebagai agen terapeutik potensial untuk kanker ovarium (37, 48, 49). Selain itu, MNA mengganggu sitotoksisitas sel CAR-T terhadap sel tumor ovarium, memberikan bukti lebih lanjut untuk penekanan kekebalan yang dimediasi MNA. Secara kolektif, hasil ini menunjukkan model di mana tumor dan sel CAF mengeluarkan MNA ke dalam TME ekstraseluler. Lewat (i) stimulasi pertumbuhan kanker ovarium yang diinduksi TNF dan (ii) penghambatan aktivitas sitotoksik sel T yang diinduksi MNA, ini mungkin memiliki efek tumor ganda (Gambar 5D).
Kesimpulannye, dengan nerapin kombinasi pengayaan sel cepat, pengurutan sel tunggal dan profil metabolisme, penelitian ini ngungkapin perbedaan imunometabolomik yang gede antara tumor dan sel ascites pada pasien HGSC. Analisis komprehensif ini nunjukin kalo ada perbedaan dalam pengambilan glukosa dan aktivitas mitokondria antara sel T, dan mengidentifikasi MNA sebagai metabolit pengatur imun otonom non-sel. Data ini berdampak pada bagaimana TME mempengaruhi metabolisme sel T pada kanker manusia. Meskipun persaingan langsung untuk nutrisi antara sel T dan sel kanker telah dilaporkan, metabolit juga dapat bertindak sebagai pengatur tidak langsung untuk mempromosikan perkembangan tumor dan mungkin menekan respons imun endogen. Deskripsi lebih lanjut tentang peran fungsional dari metabolit pengatur ini dapat membuka strategi alternatif untuk meningkatkan respon imun anti-tumor.
Spesimen pasien dan data klinis diperoleh melalui repositori jaringan tumor kanker BC yang disertifikasi oleh Canadian Tissue Repository Network. Menurut protokol yang disetujui oleh Komite Etika Penelitian Kanker BC dan Universitas British Columbia (H07-00463), semua spesimen pasien dan data klinis diperoleh persetujuan tertulis atau secara resmi menolak persetujuan mereka. Sampel disimpan di BioBank yang bersertifikat (BRC-00290). Karakteristik pasien yang rinci ditunjukin di Tabel S1 dan S5. Untuk kriopreservasi, pisau bedah digunakan untuk mengurai sampel tumor pasien secara mekanis dan kemudian mendorongnya melalui filter 100 mikron untuk mendapatkan suspensi sel tunggal. Asma pasien disentrifugasi pada 1500 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C untuk pelet sel dan menghilangkan supernatan. Sel yang didapet dari tumor dan ascites diawetkan dalam 50% serum AB manusia yang dinonaktifkan panas (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) dan 10% dimetil sulfoksida. Suspensi sel tunggal yang diawetkan ini dicairkan dan digunakan untuk metabolomik dan penentuan metabolit yang dijelaskan di bawah ini.
Media lengkap terdiri dari 0.22 μm yang disaring 50:50 ditambah RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) ditambahin dengan 10% serum AB manusia yang dinonaktifkan panas (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) x1 Larutan Penisilin Streptomisin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) dan 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) ditambahin dengan 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) dan 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Penyangga pewarnaan sitometer aliran terdiri dari 0,22 μm saline penyangga fosfat yang disaring (PBS; Invitrogen) yang ditambahkan dengan 3% serum manusia AB yang dinonaktifkan panas (Sigma). Penyangga pengayaan sel terdiri dari 0.22μm PBS yang disaring dan ditambahkan dengan 0.5% serum AB manusia yang dinonaktifkan panas (Sigma-Aldrich).
Di media lengkap 37°C, sel diwarnai dengan 10 nM MT DR dan 100 μM 2-NBDG selama 30 menit. Berikutnye, sel-sel diwarnai dengan pewarna viabilitas eF506 pada suhu 4°C selama 15 menit. Suspensi ulang sel-sel di FC Block (eBioscience) dan Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), encerkan dalam penyangga pewarnaan sitometer aliran (sesuai instruksi pabrikan), dan inkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Warnain sel-sel dengan seperangkat antibodi (Tabel S2) di penyangga pewarnaan sitometri aliran pada suhu 4°C selama 20 menit. Suspensi ulang sel-sel di penyangga pewarnaan sitometri aliran (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) sebelum dianalisis. Pake SpectroFlo dan FlowJo V10 buat nganalisis data jumlah sel, dan pake GraphPad Prism 8 buat bikin data. Intensitas fluoresensi median (MFI) dari 2-NBDG dan MT DR dinormalisasi log, dan kemudian uji t berpasangan digunakan untuk analisis statistik untuk memperhitungkan pasien yang cocok. Hapus semua populasi dengan kurang dari 40 kejadian dari analisis; masukin nilai MFI 1 buat nilai negatif sebelum ngelakuin analisis statistik dan visualisasi data.
Untuk melengkapi strategi gating manual dari panel proses di atas, kami menggunakan anotasi lengkap oleh pohon pembatasan bentuk (FAUST) (21) untuk secara otomatis menetapkan sel ke populasi setelah menghilangkan sel mati di FlowJo. Kita ngatur output secara manual buat nyatuin populasi yang keliatannye salah alokasi (menggabungkan PD1+ dengan sel tumor PD1) dan populasi yang dipertahankan. Setiap sampel mengandung rata-rata lebih dari 2% sel, untuk total 11 populasi.
Sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll dipake buat misahin PBMC dari produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies). Sel CD8 + T diisolasi dari PBMC make CD8 MicroBeads (Miltenyi) dan diperluas di media lengkap make TransAct (Miltenyi) selama 2 minggu sesuai dengan instruksi pabrik. Sel-sel dibiarin berdiri selama 5 hari di media lengkap yang mengandung IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), dan kemudian dirangsang ulang dengan TransAct. Di hari ke 7, sesuai dengan instruksi pabrik, CD45 MicroBeads manusia (Miltenyi) digunakan untuk memperkaya sel dalam tiga putaran berturut-turut. Sel-sel dibagi untuk analisis flow cytometry (seperti yang dijelaskan di atas), dan satu juta sel dibagi tiga kali untuk analisis LC-MS/MS. Sampel diproses dengan LC-MS/MS seperti yang dijelaskan di bawah ini. Kita ngira-ngira nilai metabolit yang hilang dengan jumlah ion 1,000. Setiap sampel dinormalisasi oleh jumlah ion total (TIC), dikonversi secara logaritmik dan dinormalisasi secara otomatis di MetaboAnalystR sebelum dianalisis.
Suspensi sel tunggal dari setiap pasien dicairkan dan disaring melalui filter 40 μm ke dalam medium lengkap (seperti yang dijelaskan di atas). Menurut protokol pabrikan, tiga putaran seleksi positif berturut-turut dengan pemisahan manik magnetik menggunakan MicroBeads (Miltenyi) digunakan untuk memperkaya sampel untuk sel CD8+, CD4+ dan CD45- (di atas es). Singkatnya, sel-sel disuspensikan kembali di penyangga pengayaan sel (seperti yang dijelaskan di atas) dan dihitung. Sel-sel diinkubasi dengan manik-manik CD8 manusia, manik-manik CD4 manusia atau manik-manik CD45 manusia (Miltenyi) pada suhu 4°C selama 15 menit, dan kemudian dicuci dengan penyangga pengayaan sel. Sampel dilewatin lewat kolom LS (Miltenyi), dan pecahan positif dan negatif dikumpulkan. Untuk mengurangi durasi dan memaksimalkan langkah pemulihan sel, fraksi CD8 kemudian digunakan untuk putaran kedua pengayaan CD4+, dan fraksi CD4 digunakan untuk pengayaan CD45 berikutnya. Simpan larutan di atas es selama proses pemisahan.
Buat nyiapin sampel buat analisis metabolit, sel-sel dicuci sekali dengan larutan garam dingin es, dan 1 ml metanol 80% ditambahkan ke setiap sampel, lalu diputar dan dibekukan dalam nitrogen cair. Sampel dilakuin tiga siklus beku-cair dan disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang mengandung metabolit diuapkan sampai kering. Metabolit dilarutkan kembali dalam 50 μl asam formik 0,03%, diputar untuk dicampur, dan kemudian disentrifugasi untuk menghilangkan puing-puing.
Ekstrak metabolit seperti yang dijelaskan di atas. Pindahin supernatan ke botol kromatografi cair berkinerja tinggi buat penelitian metabolomik. Pake protokol perlakuan acak buat ngerawat tiap sampel dengan jumlah sel yang sama buat mencegah efek batch. Kita ngelakuin penilaian kualitatif metabolit global yang sebelumnya dipublikasiin di AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Analisis kromatografi dan integrasi area puncak dilakukan menggunakan perangkat lunak MultiQuant versi 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Jumlah ion 1000 dipake buat ngira-ngira nilai metabolit yang hilang, dan TIC dari tiap sampel dipake buat ngitung area puncak yang dinormalisasi dari tiap metabolit yang terdeteksi buat ngoreksi perubahan yang diperkenalkan oleh analisis instrumental dari pemrosesan sampel. Setelah TIC dinormalisasi, MetaboAnalystR(51) (parameter default) digunain buat konversi logaritmik dan penskalaan garis norma otomatis. Kita make PCA dengan paket R vegan buat ngelakuin analisis eksploratif perbedaan metabolom antara jenis sampel, dan make analisis redundansi parsial buat nganalisis pasien. Pake metode Ward buat bikin dendrogram peta panas buat ngekelompokin jarak Euclidean antar sampel. Kita pake limma (52) pada kelimpahan metabolit standar untuk identifikasi metabolit yang melimpah secara berbeda di seluruh jenis sel dan lingkungan mikro. Untuk menyederhanakan penjelasan, kami menggunakan parameter rata-rata kelompok untuk menentukan model, dan mempertimbangkan jenis sel di lingkungan mikro sebagai setiap kelompok (n = 6 kelompok); untuk tes signifikansi, kami melakukan tiga pengukuran berulang untuk setiap metabolit Untuk menghindari replikasi palsu, pasien dimasukkan sebagai rintangan dalam desain limma. Buat ngecek perbedaan metabolit antara pasien yang berbeda, kite nyesuain model limma termasuk pasien dengan cara yang tetap. Kita ngelaporin signifikansi kontras yang udah ditentuin sebelumnya antara tipe sel dan lingkungan mikro Padj <0,05 (koreksi Benjamini-Hochberg).
Setelah pengayaan kekuatan menggunakan Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viabilitas), pengurutan transkriptom sel tunggal dilakukan pada total ascites beku hidup dan sampel tumor menggunakan protokol ekspresi gen 10x 5′. Lima kasus dengan tumor dan asma yang cocok dianalisis, meskipun viabilitas rendah dari satu sampel tumor mencegah inklusinya. Untuk mencapai banyak pilihan pasien, kami menggabungkan sampel dari setiap pasien di jalur pengontrol kromium 10x, dan menganalisis situs ascites dan tumor secara terpisah. Setelah sekuensing [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genom Quebec; rata-rata 73,488 dan 41,378 bacaan per sel untuk tumor dan ascites masing-masing]], kami menggunakan CellSNP dan Vireo (53) (berdasarkan CellSNP sebagai SNP manusia umum (VCF) yang disediakan oleh GRCh38 ditugaskan sebagai identitas donor. Kita menggunakan SNPRelate untuk menyimpulkan identitas terdekat (IBS) dari status genotipe pasien (IBS) kagak termasuk sel yang kagak ditugasin dan sel yang diidentifikasi sebagai dupleks dan donor yang cocok antara sampel ascites dan tumor (54). (2792 dan 4183 sel dari tumor dan ascites, masing-masing) untuk analisis Kita menggunakan clustering Louvain dari jaringan tetangga terdekat bersama (SNN) berdasarkan jarak Jaccard ke sel-sel kluster berdasarkan ekspresi. sel didefinisikan oleh ekspresi CD8A dan GZMA, tidak termasuk subkluster dengan ekspresi protein ribosom rendah. Kita mengakses data yang dipublikasikan dari Izar dkk (16), termasuk penyematan t-SNE mereka, dapat mengontrol tumpang tindih ekspresi antara penanda sel imun dan ekspresi NNMT.
PBMC dipisahin dari produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies) dengan sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Sel CD3 + diisolasi dari PBMC make manik CD3 (Miltenyi). Kalo ada atau kagak ada MNA, sel CD3+ diaktifin dengan CD3 yang terikat pelat (5μg/ml), CD28 larut (3μg/ml) dan IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Di hari terakhir ekspansi, viabilitas (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) dan proliferasi (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) dievaluasi dengan sitometri aliran. Evaluasi fungsi efektor dengan merangsang sel dengan PMA (20 ng/ml) dan ionomycin (1μg/ml) dengan GolgiStop selama 4 jam, dan pantau CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) dan TNFα-fluoresceinsothianate (TCb) BD). Rangsang qPCR dan sel ChIP dengan PMA (20 ng/ml) dan ionomycin (1μg/ml) selama 4 jam. Supernatan ELISA dikumpulkan sebelum dan sesudah stimulasi dengan PMA (20 ng/ml) dan ionomycin (1 μg/ml) selama 4 jam.
Ikuti protokol pabrikan untuk mengisolasi RNA menggunakan RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Pake QIAshredder (QIAGEN) buat homogenisasi sampel. Pake kit RNA berkapasitas tinggi ke cDNA (Thermo Fisher Scientific) buat ngesintesis DNA pelengkap (cDNA). Pake TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) buat ngukur ekspresi gen (sesuai protokol pabrikan) dengan probe berikut: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs0042755155m1, LCS1212 Hs02786624_g1 [gliseraldehida-3-fosfat dari Hidrogen (GAPDH)] dan Hs01010726_m1 (SLC22A2). Sampel dijalankan pada sistem PCR real-time StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) di pelat reaksi 96 sumur optik cepat MicroAmp (Applied Biosystems) dengan film optik MicroAmp. Nilai Ct yang melebihi 35 dianggap di atas ambang batas deteksi dan ditandai sebagai tidak terdeteksi.
Lakuin ChIP seperti yang udah dijelasin sebelumnya (58). Singkatnya, sel-sel diperlakuin dengan formaldehida (konsentrasi akhir 1,42%) dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Pake penyangga pembengkakan yang ditambahin (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl dan 0.1% NP-40) di atas es selama 10 menit, trus gantungin lagi di penyangga imunopresipitasi seperti yang dijelasin (58). Sampel kemudian disonikasi dengan siklus berikut: 10 siklus (20 pulsa 1 detik) dan waktu statis 40 detik. Inkubasi ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histon H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) dan SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) antibodi dengan sampel di 4°CC goyang semalaman. Inkubasi manik-manik protein A (Thermo Fisher Scientific) dengan sampel pada suhu 4°C dengan dikocok pelan selama 1 jam, lalu gunakan manik-manik chelex (Bio-Rad) untuk memperkaya DNA, dan gunakan proteinase K (Thermo Fisher) untuk pencernaan protein. Promotor TNFα dideteksi dengan PCR: maju, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; sebaliknya, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produk 207-bp). Gambar-gambar itu diproduksi oleh Image Lab (Bio-Rad) dan diukur pake perangkat lunak ImageJ.
Supernatan kultur sel dikumpulkan seperti yang dijelaskan di atas. Penentuan dilakukan sesuai dengan prosedur pabrikan kit ELISA TNFα manusia (Invitrogen), kit ELISA IL-2 manusia (Invitrogen) dan kit ELISA IFN-γ manusia (Abcam). Menurut protokol pabrikan, supernatan diencerin 1:100 buat ndeteksi TNFα dan IL-2, dan 1:3 buat ndeteksi IFN-γ. Pake EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) buat ngukur absorbansi di 450 nm.
PBMC dipisahin dari produk pemisahan leukosit (STEMCELL Technologies) dengan sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Sel CD3 + diisolasi dari PBMC make manik CD3 (Miltenyi). Kalo ada atau kagak ada MNA, sel CD3+ diaktifin dengan CD3 yang terikat pelat (5μg/ml), CD28 larut (3μg/ml) dan IL-2 (300 U/ml; Proleukin) selama 3 hari. Setelah 3 hari, sel-sel dikumpulkan dan dicuci dengan saline 0.9%, dan pelet dibekukan. Penghitungan sel dilakukan dengan flow cytometry (Cytek Aurora; konfigurasi 3L-16V-14B-8R) menggunakan 123count eBeads.
Ekstrak metabolit seperti yang dijelaskan di atas. Ekstrak kering direkonstitusi pada konsentrasi 4000 setara sel/μl. Analisis sampel dengan kromatografi fase terbalik (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) dan kolom CORTECS T3 (2,1×150 mm, ukuran partikel 1,6-μm, ukuran pori 120-Å; #186008500, Waters). Spektrometer massa kutub (6470, Agilent), di mana ionisasi elektrospray beroperasi dalam mode positif. Fase mobile A adalah 0.1% asam formik (dalam H2O), fase mobile B adalah 90% asetonitril, 0.1% asam formik. Gradien LC adalah 0 sampe 2 menit buat 100% A, 2 sampe 7,1 menit buat 99% B, dan 7,1 sampe 8 menit buat 99% B. Terus seimbangin lagi kolom dengan fase mobile A dengan laju aliran 0,6 ml/menit selama 3 menit. . Laju alirannye 0.4ml/menit, dan ruang kolom dipanasin sampe 50°C. Pake standar kimia murni MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) buat nentuin waktu retensi (RT) dan transformasi (RT = 0,882 menit, transformasi 1 = 137→94,1, transformasi 2 = 137→92, Konversi = 137→77). Ketika ketiga transisi terjadi pada waktu retensi yang benar, transisi 1 digunakan untuk kuantifikasi untuk memastikan spesifisitas. Kurva standar MNA (Toronto Research Chemical Company) dihasilkan oleh enam pengenceran serial larutan stok (1 mg/ml) untuk mendapatkan standar 0,1, 1,0, 10 dan 100 ng/ml dan 1,0 dan 10μg/ml masing-masing cair. Batas deteksi adalah 1 ng/ml, dan respon linier adalah antara 10 ng/ml dan 10μg/ml. Setiap injeksi dua mikroliter sampel dan standar digunain buat analisis LC/MS, dan sampel kontrol kualitas campuran dijalanin setiap delapan injeksi buat mastiin stabilitas platform analisis. Respon MNA dari semua sampel sel yang diobati MNA berada dalam rentang linier dari assay. Analisis data dilakukan menggunakan perangkat lunak analisis kuantitatif MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstruksi αFR-CAR generasi kedua diambil dari Song dkk. (59). Singkatnya, konstruksi berisi isi berikut: urutan pemimpin CD8a, fragmen variabel rantai tunggal spesifik αFR manusia, engsel CD8a dan wilayah transmembran, domain intraseluler CD27 dan domain intraseluler CD3z. Urutan CAR lengkap disintesis oleh GenScript, dan kemudian dikloning ke dalam vektor ekspresi lentivirus generasi kedua di hulu kaset ekspresi GFP yang digunakan untuk mengevaluasi efisiensi transduksi.
Lentivirus diproduksi dengan transfeksi sel HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); ditanam di media Eagle yang dimodifikasi Dulbecco yang mengandung 10% serum sapi janin (FBS) dan 1% PenStrep, dan make vektor CAR-GFP dan plasmid kemasan (psPAX2 dan pMD2.G, Addgene) make amina lipofection (Sigma-Aldrich). Supernatan yang mengandung virus dikumpulkan 48 dan 72 jam setelah transfeksi, disaring, dan dikonsentrasikan dengan ultrasentrifugasi. Simpan supernatan virus pekat di -80°C sampe transduksi.
PBMC dipisahin dari produk pemisahan leukosit donor sehat (STEMCELL Technologies) dengan sentrifugasi kepadatan gradien Ficoll. Pake seleksi positif CD8 microbeads (Miltenyi) buat ngisolasi sel CD8+ dari PBMC. Rangsang sel T dengan TransAct (Miltenyi) dan di medium TexMACS [Miltenyi; ditambahin dengan 3% serum manusia yang dinonaktifkan panas, 1% PenStrep dan IL-2 (300 U/ml)]. Dua puluh empat jam setelah stimulasi, sel T ditransduksi dengan lentivirus (10 μl supernatan virus pekat per 106 sel). 1 sampe 3 hari setelah transduksi di Cytek Aurora (di FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evaluasi ekspresi GFP sel untuk nunjukin efisiensi transduksi setidaknya 30%.
Sel CAR-T dikultur selama 24 jam di Immunocult (STEMCELL Technologies; ditambahin dengan 1% PenStrep) dalam kondisi berikut: kagak diobati, diobati dengan 250 μM adenosin atau 10 mM MNA. Setelah praperawatan, sel CAR-T dicuci dengan PBS dan dikombinasikan dengan 20.000 sel SK-OV-3 [ATCC; di medium McCoy 5A (Sigma-Aldrich) yang ditambahin 10% FBS dan 1% PenStrep di 10: Rasio efektor ke target 1 diperkuat dalam tiga kali lipat di medium Immunocult yang ditambahin. Sel SK-OV-3 dan sel SK-OV-3 yang dilisis dengan digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) digunakan sebagai kontrol negatif dan positif, masing-masing. Setelah 24 jam budidaya bersama, supernatan dikumpulkan dan laktat dehidrogenase (LDH) diukur sesuai dengan instruksi pabrik (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatan LDH diencerin 1:50 di penyangga LDH. Persentase pembunuhan diukur pake rumus berikut: persentase pembunuhan = persentase koreksi / tingkat pembunuhan maksimum x 100%, di mana persentase koreksi = ko-kultur-sel T doang, dan tingkat pembunuhan maksimum = kontrol positif-kontrol negatif.
Seperti yang dijelasin di teks atau bahan dan metode, pake GraphPad Prism 8, Microsoft Excel atau R v3.6.0 buat analisis statistik. Kalo beberapa sampel dikumpulkan dari pasien yang sama (seperti asma dan tumor), kita pake tes t berpasangan atau masukin pasien sebagai efek acak dalam model linier atau umum sesuai. Untuk analisis metabolomik, tes kepentingan dilakukan dalam tiga kali lipat.
Buat bahan tambahan buat artikel ini, tolong liat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, yang memungkinkan penggunaan, distribusi dan reproduksi di media apapun, selama penggunaan akhir bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah bahwa karya aslinya benar. Petunjuk.
Catatan: Kita cuma minta lu buat ngasih alamat email lu biar orang yang lu rekomendasiin ke halaman tau kalo lu pengen mereka ngeliat emailnya dan kalo itu bukan spam. Kita kagak bakalan ngambil alamat email.
Pertanyaan ini dipake buat ngetes apakah lu pengunjung dan mencegah pengiriman spam otomatis.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.Bellson), Deraphardnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA berkontribusi pada penekanan kekebalan sel T dan mewakili target imunoterapi potensial untuk pengobatan kanker manusia.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephrini (R.R.Bellson), Deraphardnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA berkontribusi pada penekanan kekebalan sel T dan mewakili target imunoterapi potensial untuk pengobatan kanker manusia.
©2021 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Sains. semua hak dilindungi. AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.